1 UVOD
Če biološko celico izpostavimo zunanjemu
električnemu polju dovolj visoke jakosti, pride v celični
membrani do strukturnih sprememb, ki omogočajo
transport snovi skozi membrano. Elektroporacijo, kot se
pojav imenuje, je mogoče nadzorovati s primerno izbiro
parametrov električnih pulzov [1]. Električni pulzi
nižjih napetosti celico elektroporirajo le začasno, tako
da se po preteku nekaj minut celična membrana zaceli,
celične funkcije pa se povrnejo v fiziološko stanje [2].
Ta pojav se imenuje reverzibilna elektroporacija in ga
večinoma uporabljamo za vnos snovi v celice [3-5].
Električni pulzi višjih napetosti pa povzročijo
ireverzibilno elektroporacijo, ki vodi v celično smrt [6].
V zadnjih letih so pričeli ireverzibilno elektroporacijo
uporabljati v medicini za ablacijo tkiva [7]. Njena
glavna prednost pred drugimi ablacijskimi metodami je
njeno netermično učinkovanje, saj smrt celic namesto
Prejet 1. oktober, 2010
Odobren 17. december, 2010
SEGREVANJE TKIVA MED ABLACIJO TUMORJEV Z IREVERZIBILNO ELEKTROPORACIJO 43
visokih ali nizkih temperatur, kot pri večini ostalih
ablacijskih metod, povzroči lokalno električno polje.
Tako se proteini v ekstracelularnem matriksu ohranijo, s
tem pa se pospeši regeneracija tkiva [6].
Za uspešno ablacijo ciljnega tkiva z ireverzibilno
elektroporacijo je potrebno v tkivu doseči električno
polje dovolj visoke jakosti. To je moč zagotoviti z
numeričnim načrtovanjem zdravljenja, kot smo že
prikazali v dosedanjih raziskavah na primeru
elektrokemoterapije globoko ležečega tumorja [8,9]. S
kombinacijo analize medicinskih slik, gradnje
anatomsko-realistične geometrije, numeričnih izračunov
porazdelitve električnega polja in optimizacije je
mogoče izračunati optimalne položaje posameznih
elektrod in napetosti med njimi, ki bodo vodile do
uspešne (reverzibilne ali ireverzibilne) elektroporacije
tkiva. Pri ablaciji z ireverzibilno elektroporacijo je poleg
jakosti električnega polja v tkivu potrebno upoštevati
tudi segrevanje tkiva zaradi Joulskih izgub, saj se v
primeru termične smrti celic in denaturizacije
ekstracelularnih proteinov izgubijo prednosti
ireverzibilne elektroporacije pred ostalimi ablacijskimi
metodami. V ta namen smo v naš postopek za
načrtovanje zdravljenja za elektrokemoterapijo [8,9]
dodali še izračun Joulskega segrevanja zaradi
izpostavitve tkiva zunanjemu električnemu polju.
Preverili smo, kolikšno segrevanje tkiva povzročajo
električni pulzi, ki se trenutno uporabljajo pri ablaciji z
ireverzibilno elektroporacijo in preverili trajanje
optimizacijskega postopka, v katerem bolj ali manj
natančno računamo segrevanje tkiva med ireverzibilno
elektroporacijo. Ob tem smo predlagali poenostavitev
izračuna segrevanja, ki bistveno skrajša čas
optimizacije.
Slika 1: Geometrija tkiva za optimizacijo z ireverzibilno
elektroporacijo: šest elektrod, postavljenih v dveh vrstah v
okolico sredinsko postavljenega tumorja. Desno od tumorja je
krogla, ki pomeni kritično tkivo, v katerem električna poljska
jakost ne sme preseči praga ireverzibilne elektroporacije.
2 METODE
Vse izračune v raziskavi smo opravili na realni
geometriji podkožnega tumorja, v okolico katerega so
bile vstavljene igelne elektrode (Slika 1) [10]. V bližino
tumorja smo postavili tkivo krogelne oblike, ki
predstavlja kritično tkivo, v katerem električno polje ne
sme preseči praga ireverzibilne elektroporacije [11]. V
praksi bi tkivo lahko predstavljajo pomembnejše živce
ali pa srčno mišico.
Za numerično računanje smo uporabili paket za
reševanje diferencialnih enačb z metodo končnih
elementov Comsol Multiphysics 3.5a (COMSOL AB,
Švedska). Porazdelitev električnega potenciala v
geometriji smo iskali z reševanjem Laplaceove
diferencialne enačbe:
( ) 0Vσ∇ ⋅ ⋅∇ = ,  (1)
kjer je σ električna prevodnost tkiva in V električni
potencial. Pri tem smo uporabili sledeče robne pogoje:
1) konstanten električni potencial na aktivnih elektrodah
V k=   (2)
in 2) električno izolacijo
1 2( ) 0n J J⋅ − =   (3)
na vseh zunanjih robnih ploskvah geometrije.
Za matematični model elektroporacije smo izbrali t.i.
sekvenčni model, ki upošteva spreminjanje električne
prevodnosti med elektroporacijo – prevodnost tako
postane funkcija električnega polja [12,13]:
2 1
1( )
irr rev
E E
E E
σ σ
σ σ
−
= ⋅ +
−
, (4)
kjer sta σ1 oziroma σ2 električna prevodnost ne-
elektroporiranega oziroma elektroporiranega tkiva, Erev
oziroma Eirr pa pragova reverzibilne oziroma
ireverzibilne elektroporacije.
Visokonapetostni električni pulzi poleg
elektroporacije v bioloških tkivih povzročajo tudi
segrevanje. Segrevanje tkiv zaradi električnih pulzov
smo opisali s Pennesovo biotoplotno enačbo [14]:
( ) ( )
b b b b m
T
c k T c w T T Q Q
t
ρ ρ
∂
= ∇ ⋅ ∇ − − + +
∂
,  (5)
kjer je T temperatura, ρ gostota tkiva, c toplotna
kapaciteta tkiva, ρb, cb, wb in Tb gostota, toplotna
kapaciteta, pretok in temperatura krvi (v tem zaporedju),
k toplotna prevodnost tkiva, Qm toplota v tkivu, ki
nastane z metabolizmom, in Q toplota v tkivu, ki
nastane zaradi zunanjih virov, v našem primeru Joulskih
izgub zaradi izpostavitve tkiva zunanjemu električnemu
polju. Vrednosti posameznih parametrov v enačbi (4) in
44  ŽUPANIČ, MIKLAVČIČ
enačbi (5) so bile pridobljene iz znanstvene literature in
so zapisane v Tabeli 1 [12, 15].
Tabela 1: Parametri uporabljeni pri izračunu porazdelitve
električnega polja in porazdelitve temperature z enačbami (1),
(4) in (5) med dovajanjem električnih pulzov pri ireverzibilni
elektroporaciji. Upoštevani toplotni parametri so bili enaki za
vsa tkiva, med tem ko smo pri elektroporacijskih parametrih
upoštevali različne vrednosti za tumor in druga tkiva.
Parameter Vrednost
σ1
tumor 0.2 S/m
σ2
tumor 0.8 S/m
σ1
tissue 0.1 S/m
σ2
tissue 0.4 S/m
Erev
tumor 400 V/cm
Eirr
tumor 900 V/cm
Erev
tissue 200 V/cm
Eirr
tissue
800 V/cm
ρ 1050 kg/m3
c 3600 J/(kg·K)
k 0.51 W/(m·K)
ρb 1060 kg/m
3
cb 3600 J/(kg·K)
wb 0.0044 s
-1
Tb 37 °C
Qm 420 W/m
3
Slika 2 prikazuje izračun porazdelitve temperature z
enačbo (5) po koncu zadnjega električnega pulza, za
50×100 µs električnih pulzov amplitude 500 V.
Za hitrejšo oceno dviga temperature v tkivu smo
namesto enačbe (5) uporabili enačbo (6), ki upošteva
zgolj električni tok kot toplotni vir, medtem ko
zanemari prevajanje toplote, odvajanje toplote preko
krvnega pretoka in metabolizem:
2
E Nt
T
c
σ
ρ
∆ = ,  (6)
kjer je N število električnih pulzov in t trajanje pulzov,
σ, ρ in c pa so definirane že v enačbi (5). Izračun
segrevanja z enačbo (6) da višje temperature kot izračun
z enačbo (5), zato je mogoče enačbo (6) uporabiti kot
konservativno oceno segrevanja med ireverzibilno
elektroporacijo.
Za hitrejšo oceno dviga temperature v tkivu smo
namesto enačbe (5) uporabili enačbo (6), ki upošteva
zgolj električni tok kot toplotni vir, medtem ko
zanemari prevajanje toplote, odvajanje toplote preko
krvnega pretoka in metabolizem:
2
E Nt
T
c
σ
ρ
∆ = ,  (6)
Slika 2: Porazdelitev temperature po 50×100 µs električnih
pulzih amplitude 500 V, izračunano z enačbo (5). Najvišja
temperatura, dosežena blizu elektrod, je bila 38,1 °C (311,1
K), medtem ko je temperatura v središču tumorja dosegla 39,3
°C (312,3 K).
kjer je N število električnih pulzov in t trajanje pulzov,
σ, ρ in c pa so definirane že v enačbi (5). Izračun
segrevanja z enačbo (6) da višje temperature kot izračun
z enačbo (5), zato je mogoče enačbo (6) uporabiti kot
konservativno oceno segrevanja med ireverzibilno
elektroporacijo.
Slika 3 prikazuje izračun porazdelitve temperature z
enačbo (6) po zaključku elektroporacije za 50×100 µs
električnih pulzov amplitude 500 V.
Za optimizacijo položajev elektrod in napetosti med
njimi smo uporabili genetski algoritem [16].
Uporabljena kriterijska funkcija je kot vhod sprejela
porazdelitev električnega polja v tkivu, kot izhod pa
dala vrednost kriterija. Začetno populacijo rešitev smo
določili naključno, pri tem pa smo upoštevali naslednje
omejitve: nabor sprejemljivih razdalj med vrstama
elektrod, globin vstavljanja elektrod in napetosti med
vrstama elektrod. Rešitve so se iz generacije v
generacijo razmnoževale z verjetnostmi
proporcionalnimi vrednostim njihovih kriterijskih
funkcij:
iji j j
i irr j irr j rev ij
F a E b E c E d T= − − −∑ ∑ ∑ ∑ , (7)
kjer so ai, bj, cj in dij uteži, ki kažejo pomen posameznih
faktorjev za učinkovito ireverzibilno elektroporacijo. Ti
faktorji so pokritost tumorja (ciljnega tkiva) (i) in drugih
tkiv (j) z električnim poljem nad pragom reverzibilne
Erev ali ireverzibilne elektroporacije Eirr in dosežena
temperatura v tkivu T.
SEGREVANJE TKIVA MED ABLACIJO TUMORJEV Z IREVERZIBILNO ELEKTROPORACIJO 45
Slika 3: Porazdelitev temperature po 50×100 µs električnih
pulzih amplitude 500 V, izračunano z enačbo (6). Najvišja
temperatura, dosežena blizu elektrod, je bila 67,3 °C (340,3
K), medtem ko je temperatura v središču tumorja dosegla 43,2
°C (316,2 K).
Tabela 2: Parametri, uporabljeni v genetskem algoritmu in
kriterijski funkciji
Parameter Vrednost
ai 100
bj 20
cj 2
dij 10
p 0.25
Pmut 0.4
Pcross 0.6
Nove rešitve, ki sestavljajo nove populacije rešitev,
so nastale iz prejšnjih rešitev z operacijama križanja
(enačba (8)) in mutacije (enačba (9)), ki sta izbrani z
vnaprej določenima verjetnostma Pmut in Pcross:
[ ]1 (1 ) ; 0,1i i i i i iz e x e y e+ = ⋅ + − ⋅ ∈  (8)
[ ]1 ; ,i i i i iz x f x f p p+ = + ⋅ ∈ − , (9)
kjer so zi+1 rešitve v naslednji generaciji, xi in yi,
rešitve v predhodni generaciji, ei in fi pa naključno
izbrane uteži iz zgoraj navedenih intervalov. Tabela 2
prikazuje parametre genetskega algoritma, uporabljene
v študiji.
3 REZULTATI
V prvem delu študije smo opravili nekaj izračunov
dviga temperature v tkivu med ireverzibilno
elektroporacijo z uporabo enačbe (5). Ker je izračun
posamezne porazdelitve temperature trajal več minut, iz
prejšnjih študij pa smo potrebno število izračunov v
optimizacijskih postopkih elektroporacije ocenili na vsaj
nekaj tisoč [8], smo ocenili, da bi celoten optimizacijski
postopek lahko trajal več dni ali celo tednov. Ker je
treba načrt zdravljenja v kliničnem okolju zagotoviti
čim prej, smo se odločili temperaturno porazdelitev
izračunati na drug način, ki pa bi bil še vedno dovolj
natančen, a veliko hitrejši od postopka izračuna z
enačbo (5).
Odločili smo se za preizkus postopka »screening«,
pri katerem smo za izračun porazdelitve temperature
uporabili konservativni približek (enačba (6)), medtem
ko smo enačbo (5) uporabili samo v primerih, ko je
rezultat približka nakazoval čezmerno segrevanje tkiva
– v našem primeru najvišjo temperaturo nad 50 °C.
Tako smo enačbo (5) uporabili samo pri 12 % vseh
izračunov v optimizaciji, skupen čas računanja pa smo
skrajšali na 29 ur – čas, ki bi bil sprejemljiv za
načrtovanje v kliničnem okolju. Po končani optimizaciji
smo primernost načrta zdravljenja verificirali z enačbo
(5). Primerjava načrtov zdravljenja, pridobljenih z
osnovnim postopkom in s postopkom »screening«
(optimizacija z uporabo enačbe (5) je bila izvedena
zgolj zaradi te primerjave – trajala je 11 dni) je
pokazala, da se med seboj bistveno ne razlikujeta
(tabela 3).
Tabela 3: Primerjava rezultatov načrtovanja zdravljenja z
ireverzibilno elektroporacijo za osnovni in »screening«
postopek: primerjani so volumen ireverzibilno
elektroporariranega tumorja (i) in kritičnega tkiva (j) ter
maksimalna temperature v tkivu.
Postopek Eirr(
i) [%] Eirr(
j) [%] Tmax [°C]
Osnovni 100 0,05 39,3
»Screening« 100 0,09 39,3
Slika 4 prikazuje, kako se temperatura v okolici
elektrod in v središču tumorja spreminja med
dovajanjem električnih pulzov (za izračun je bila
uporabljena enačba (5)). Pri tem smo uporabili
optimalne parametre, kot so bili določeni z optimizacijo
in postopkom »screening«, pri čemer se rezultati brez
uporabe postopka »screening« niso bistveno razlikovali.
Iz slike 4 je razvidno, da se zaradi visoke toplotne
prevodnosti elektrod, ki delujejo kot toplotni ponor,
med zaporednima električnima pulzoma temperatura v
okolici elektrod močno zniža, medtem ko je ta
sprememba v tumorju veliko manjša. Zato je
temperature po zaključku zadnjega pulza v tumorju
višja kot v okolici elektrod.
46  ŽUPANIČ, MIKLAVČIČ
Slika 4: Temperatura v središču tumorja in poleg ene izmed
elektrod med 50 100 µs električnimi pulzi amplitude 500 V,
izračunano z enačbo (5). Najvišja temperatura, dosežena blizu
elektrod, je bila 39,1 °C (312,1 K), medtem ko je temperatura
v središču tumorja dosegla 39,3 °C (312,3 K).
4 RAZPRAVA
Ker je netermično uničenje celic ena najpomembnejših
lastnosti ireverzibilne elektroporacije za ablacijo tkiva,
smo v postopek za načrtovanje zdravljenja pri
medicinski uporabi elektroporacije [8], ki smo ga razvili
za elektrokemoterapijo, dodali izračun porazdelitve
temperature med dovajanjem električnih pulzov.
Optimizacija skupaj z natančnim izračunom
porazdelitve temperature (enačba (5)) je trajala
predolgo, zato smo poskusili s poenostavitvijo izračuna
porazdelitve temperature (enačba (6)), ki je bila manj
točna, a je bil njen izračun veliko hitrejši. Rezultati
kažejo, da se kakovost načrta zdravljenja zaradi
uporabljene poenostavitve računanja ni bistveno
spremenila, medtem ko se je čas, potreben za pridobitev
načrta, močno skrajšal, iz 11 dni na 29 ur. Ocenjujemo,
da bi bilo računanje porazdelitve temperature v tkivu  z
enačbo (5) potrebno zgolj, če bi v prihodnosti začeli za
ablacijo uporabljati več pulzov višjih napetosti ali pa
višje ponavljalne frekvence. Ob uporabi trenutnih
parametrov električnih pulzov pa je predstavljen
postopek za načrtovanje ablacije z ireverzibilno
elektroporacijo povsem primeren za uporabo v kliničnih
študijah.
Pred nami so že v nekaj študijah poskušali s pomočjo
numeričnega modeliranja oceniti dvig temperature v
tkivu med ablacijo z ireverzibilno elektroporacijo
[17,18]. Ugotovili so, da obstajajo »varni« parametri
električnih pulzov, ki ne povzročajo pretiranega
segrevanja tkiva. A ker te študije niso upoštevale
sprememb prevodnosti, ki so posledica elektroporacije
in ki dodatno povečajo segrevanje prek povečanja
električnega toka, ki teče skozi tkivo [19], smo njihove
izračune ponovili, pri tem pa smo uporabili sekvenčni
model elektroporacije, ki spremembo prevodnosti
upošteva. Naši izračuni dviga temperature v tkivu ob
parametrih električnih pulzov, ki jih trenutno
uporabljajo v kliničnih študijah (50×100 µs električnih
pulzov, s ponavljalno frekvenco 1 Hz in razmerjem med
napetostjo in razdaljo med elektrodami približno 2000
V/cm) [20], so pokazali, da do pretiranega segrevanja
tkiva, ki bi povzročilo termične poškodbe, med
ireverzibilno elektroporacijo ne pride, s čimer smo
potrdili rezultate prejšnjih študij.
Predstavljeni postopek načrtovanja zdravljenja raka z
ireverzibilno elektroporacijo je prvi primer numeričnega
načrtovanja zdravljenja, namenjen kliničnemu okolju. V
prihodnjih raziskavah bi bilo treba postopek validirati v
študijah in vivo ireverzibilne elektroporacije ter nato
prek posvetovanj z uporabniki (zdravniki in kirurgi)
prilagoditi kliničnim potrebam.
ZAHVALA
Avtorja se zahvaljujeta Agenciji za raziskovalno
dejavnost Republike Slovenije za finančno podporo.