1 UVOD
Elektroporacijo poznamo kot pojav, pri katerem se pod
vplivom električnih pulzov znatno poveča prepustnost
membran bioloških celic [1]. Pojav ima visoko
uporabno vrednost, saj ga lahko izkoristimo za vnos
različnih molekul v celice, tj. molekul, ki celične
membrane v normalnih razmerah ne morejo prosto
prehajati. Med drugim lahko z elektroporacijo
povečamo vnos kemoterapevtikov v tumorske celice in
s tem izboljšamo učinkovitost kemoterapije ter vnesemo
v celice molekule DNA za gensko transfekcijo ali kot
DNA-cepivo [2]. Z elektroporacijo lahko dosežemo tudi
ekstrakcijo molekul iz celic, na primer sladkorja iz
sladkorne pese ter taninov in pigmentov iz grozdja pri
proizvodnji vina [3].
Pri elektroporaciji je za doseganje želenih rezultatov
ključnega pomena izbira parametrov električnih pulzov
(oblike, dolžine, amplitude, števila in ponavljalne
frekvence). Če so parametri pulzov ustrezno izbrani, je
elektroporacija reverzibilna in celice se v nekaj
sekundah ali minutah po izpostavitvi pulzom povrnejo v
normalno stanje. Običajno se pri protokolih, ki
zahtevajo reverzibilno elektroporacijo, uporablja
zmerno število pravokotnih pulzov (1–8) pri ponavljalni
frekvenci 1 Hz, z dolžino posameznega pulza v
območju mikrosekund do milisekund in z amplitudo, ki
zagotovi jakost električnega polja do nekaj 100 V/cm. Z
večanjem števila, dolžine in/ali amplitude pulzov pa
postanejo spremembe v celični membrani ireverzibilne
in celice ne preživijo izpostavitve električnim pulzom.
Ireverzibilna elektroporacija se uporablja za ablacijo
tumorskih celic [4,5] in za inaktivacijo bakterij v vodi in
Prejet 3. marec, 2014
Odobren 26. marec, 2014
RAZLIČNI MODELI ELEKTROPORACIJE IN TRANSPORTA MOLEKUL PREK CELIČNE MEMBRANE 65
tekoči hrani [2,6]. Če skrajšamo dolžino pulzov v
območje nanosekund in povišamo amplitudo na nekaj
10 kV/cm, pa lahko s pulzi sprožimo tudi programirano
celično smrt – apoptozo [7,8].
Izbor parametrov električnih pulzov je torej odvisen
predvsem od namena uporabe elektroporacije. Pri
načrtovanju teh parametrov pa si lahko pomagamo s
teoretičnimi modeli. V literaturi najdemo več modelov
elektroporacije, pri čemer se ti razlikujejo bodisi v
osnovnih enačbah, ki elektroporacijo opisujejo, bodisi v
numerični metodi reševanja teh enačb. Praviloma
različne numerične metode reševanja istih enačb vodijo
do enakih rezultatov. Nasprotno pa lahko izbira
matematično-fizikalne predstavitve elektroporacije
pomembno vpliva na pridobljene rezultate ter
posledično ugotovitve numeričnega modeliranja. Zato
bova v nadaljevanju opisala štiri modele elektroporacije,
ki jih najpogosteje srečamo v literaturi. Posebej se bova
osredinila na značilnosti modelov, ki so pomembne za
sočasno modeliranje transporta molekul prek
membrane. Modeliranje transporta namreč lahko
pomembno pripomore k optimizaciji eksperimentalnih
protokolov za vnos molekul v celice. Za ustrezno
modeliranje transporta prek elektroporirane membrane
pa je temeljni pogoj ustrezna izbira modela
elektroporacije. Da prikaževa tudi praktično vrednost
modeliranja elektroporacije, bova na koncu predstavila
še dva primera uporabe modelov, in sicer pri
optimizaciji elektrozlivanja celic in pri interpretaciji
eksperimentalnih rezultatov, povezanih z vnosom
molekul v celice.
2 MODELI ELEKTROPORACIJE
Modeli elektroporacije, ki jih bova na kratko opisala, so
si sorodni, saj vsi temeljijo na predpostavki, da pod
vplivom električnega polja v lipidnem dvosloju
(gradniku celične membrane) nastanejo vodne pore, ki
ionom in molekulam omogočijo prehod prek membrane.
Čeprav por v membrani z obstoječimi mikroskopskimi
tehnikami za zdaj ni mogoče »videti«, so njihov
nastanek potrdile simulacije molekularne dinamike
lipidnega dvosloja v električnem polju [9,10]. Obenem
je teorija nastanka por edina od predlaganih teorij
elektroporacije ustrezno razložila eksperimentalna
opažanja na ravninskih lipidnih dvoslojih in celicah ter
je danes široko sprejeta [11–13].
Za lažje razumevanje same elektroporacije je na
slikah 1a–c shematsko prikazan običajni protokol
elektroporacije celic. Slike 1d–f pa pomenijo podporo k
razumevanju spodaj predstavljenih modelov.
2.1 Enačba Smoluchowskega
Prva obširna teoretična analiza elektroporacije v smislu
nastanka por v membrani sega v leto 1979, ko je
skupina ruskih znanstvenikov objavila rezultate raziskav
na ravninskih lipidnih dvoslojih [14]. Da bi opisali
časovno dinamiko širjenja in krčenja por v lipidni
membrani, so uporabili enačbo Smoluchowskega [15]:
( ) ( )
p c p d p
p p p
n n n W
D S r S r
t r r kT r
    
     
     
,  (1)
pri čemer n(rp,t) pomeni porazdelitveno funkcijo števila
por v membrani glede na njihov radij rp ob času t.
Elektroporacija je namreč stohastičen proces in
predvideva se, da se v membrani nahaja populacija por
različnih velikosti. Tako je ndrp enako številu por z
radijem med rp in rp + drp. Parametra Dp in ΔW(rp) sta
difuzijska konstanta por v prostoru njihovih radijev in
sprememba energije lipidne membrane, ki je posledica
nastanka pore, k je Boltzmannova konstanta, T pa
temperatura.
Sprememba energije ΔW ima več prispevkov, od
katerih je za elektroporacijo najpomembnejši prispevek
električne energije. Ker je lipidna membrana električno
slabo prevodna, se ob izpostavitvi električnemu polju na
njej vzpostavi električna napetost Um. Ko v lipidnem
dvosloju z nizko relativno dielektričnostjo l  2
nastane vodna pora z relativno dielektričnostjo w  80,
se sprememba v kapacitivnosti membrane Cp odrazi
kot sprememba kapacitivne energije:
2
2

  
p m
el
C U
W  (2)
Medtem ko leva stran enačbe (1) opisuje dinamiko
obstoječih por, povzema desna stran enačbe nastajanje
novih Sc(rp) in izginjanje obstoječih por Sd(rp). Izraz, ki
opisuje nastajanje por, je proporcionalen eksponentu
negativne spremembe električne energije in s tem
kvadratu transmembranske napetosti [15,16]:
2
( ) exp exp
2
  
          
p mel
c p
C UW
S r
kT kT
(3)
Transmembranska napetost torej igra ključno vlogo pri
nastajanju, širjenju in krčenju por.
Čeprav je bila osnovna teorija elektroporacije razvita na
podlagi raziskav na ravninskih lipidnih dvoslojih, je bilo
pozneje pokazano, da se celične membrane kvalitativno
obnašajo na enak način [12]. Tako enačbo
Smoluchowskega danes uporabljamo tudi za opisovanje
elektroporacije celičnih membran [17].
2.2 Asimptotični model elektroporacije
Zgoraj opisana enačba Smoluchowskega podrobno
popisuje elektroporacijo, vendar je enačba analitično
nerešljiva. Zaradi eksponentnega izraza (3) pa je
zahtevna tudi za numerično reševanje. Zato sta Neu in
Krassowska za opis elektroporacije predlagala
asimptotično redukcijo parcialne diferencialne enačbe
(1) v navadno diferencialno enačbo [15]:
66  REMS, MIKLAVČIČ
2 2
0
d
e 1 e
d
m m
ep ep
U U
q
U UN N
t N

   
   
   
   
 
 
 
 
 
 
(4)
Če v enačbi (1) n pomeni porazdelitev populacije por v
prostoru njihovih radijev, potem N pomeni gostoto por
(celotno število por na enoto površine membrane Am), ki
jo določimo kot:
0
1
d

  p
m
N n r
A
(5)
Parametri modela , Uep, N0 in q so konstante, ki jih je
sicer mogoče oceniti iz parametrov enačbe (1). Ker so
zadnji na splošno znani le na velikostni razred natančno,
pa so bili , Uep, N0 in q izbrani tako, da je model
ustrezno opisal rezultate eksperimentov na ovarijskih
celicah morskega ježka [18,19].
2.3 Razširjeni asimptotični model elektroporacije
Pri asimptotičnem modelu predpostavimo, da imajo vse
pore enak radij. Praktično gledano, enačba (4) povzema
le hitrost nastajanja in izginjanja por, torej izraz Sc(rp) +
Sd(rp) na desni strani enačbe (1). Zaradi te omejitve sta
Neu in Krassowska asimptotični model razširila s še eno
navadno diferencialno enačbo, ki opisuje širjenje in
krčenje vsake posamezne pore [20,21]:
, ,
,
d ( )
, 1,2,...,
d

  

p j p p j
p j
r D W r
j M
t kT r
(6)
V enačbi (6) pomeni rp,j radij j-te pore v membrani, pri
čemer je M celotno število por, ki so nastale v skladu z
enačbo (4). W je sprememba energije iz enačbe (1).
Omenimo na tem mestu, da je razširjeni asimptotični
model sicer laže rešljiv kot enačba Smoluchowskega.
Vendar se moramo zavedati, da je treba enačbo (6) v
Slika 1: Shematski prikaz elektroporacije. (a–c) Običajni protokol elektroporacije celic. (a) Celice v suspenziji ali pritrjene na
podlago inkubiramo v mediju, ki vsebuje molekule, ki jih želimo vnesti v celice. Obenem v posodo, kjer se nahajajo celice,
namestimo elektrode (prikazane kot črno območje na levi in desni strani). (b) Na elektrode dovedemo enega ali več električnih
pulzov izbrane oblike, dolžine, amplitude in ponavljalne frekvence, ki povzročijo elektroporacijo celičnih membran. Dokler so
celice elektroporirane, lahko molekule iz okoliškega medija prehajajo v celico. (c) Če so parametri pulzov ustrezno izbrani, se
celične membrane po nekaj sekundah ali minutah (odvisno od vrste celic in eksperimentalnih pogojev) zacelijo. Vnesene
molekule ostanejo ujete v celici, kjer lahko začnejo učinkovati. (d) Povečan prikaz elektroporirane celice. (e) Graf, ki prikazuje
transmembransko napetost (črna črta) in gostoto por v membrani (siva črta) 100 s po izpostavitvi pravokotnemu električnemu
pulzu, ki povzroči električno poljsko jakost med elektrodama E = 1 kV/cm. Transmembranska napetost doseže najvišjo absolutno
vrednost na levi in desni strani celice (glej d). Ker je nastanek por eksponentno odvisen od kvadrata transmembranske napetosti,
na tem območju membrane nastane veliko por. Nastanek por znatno zmanjša upornost membrane, zato se transmembranska
napetost nekoliko sesede. To opazimo kot sploščen potek transmembranske napetosti v okolici  = 90° in  = 270°. Če ne bi
prišlo do elektroporacije, bi bil potek transmembranske napetosti vzdolž membrane kosinusen, kar je na grafu nakazano s črno
prekinjeno črto. Izračun je bil dobljen z asimptotičnim modelom elektroporacije (glej razdelek 2.2) za celico z radijem 10 m pri
fizioloških pogojih. (f) Shematski prikaz nastanka pore na molekularni ravni. V lipidnem dvosloju, iz katerega je zgrajena celična
membrana, nastane pora tako, da se lipidi s svojimi glavami obrnejo v notranjost pore. Če je transmembranska napetost prisotna
dovolj dolgo, se pora začne širiti.
RAZLIČNI MODELI ELEKTROPORACIJE IN TRANSPORTA MOLEKUL PREK CELIČNE MEMBRANE 67
principu rešiti za vsako posamezno poro, ki nastane v
membrani. Ker je por lahko tudi več kot 10
4
, postane
reševanje modela zelo potratno v smislu računalniškega
časa. Z dobrim računskim algoritmom pa je mogoče čas
računanja skrajšati na sprejemljivo dolžino [21].
2.4 Elektroporacija kot reakcijska shema
V nasprotju z enačbo Smoluchowskega lahko nastajanje
por predstavimo tudi z reakcijsko shemo, ki opisuje
prehajanje lipidne membrane iz neelektroporirane faze
(C) v elektroporirano fazo (P): (C)  (P) [22,23]. Na
podlagi spremljanja vnosa molekul v celice med
elektroporacijo je bilo pokazano, da morata obstajati
najmanj dve stopnji C in dve stopnji P [22].
Najpreprostejša reakcijska shema je tako:
31 2
1 1 2
pp p kk k
kk k
C C P P
 
     (7)
V zgornji shemi predpostavljamo, da obstajata dva tipa
por, P1 in P2. Pri tem so pore P2 tiste, ki omogočajo
transport molekul. Konstanta reakcijske hitrosti kp pa je
odvisna od eksponenta spremembe električne energije,
enako kot pri izrazu (3):
2
0
exp
2
p m
p p
C U
k k
kT
 
  
 
 
(8)
Ob prisotnosti transmembranske napetosti je kp bistveno
večja od konstant k-1, k-2 in k-3 in prevladuje nastajanje
por. Po umiku transmembranske napetosti pa se pore
začnejo celiti v skladu s hitrostnimi konstantami k-3 <
k-2 < k-1, ki jih lahko obravnavamo kot neodvisne od
transmembranske napetosti [22].
S primerjavo vseh opisanih modelov opazimo, da so si v
osnovi zelo podobni. Vsi vsebujejo sorodne izraze, ki
opisujejo nastajanje por pod vplivom transmembranske
napetosti. Bistvena razlika med modeli pa je način, kako
obravnavajo velikost por. Asimptotični model in model
po reakcijski shemi predpostavljata konstantne velikosti
por, medtem ko enačba Smoluchowskega in razširjeni
asimptotični model obravnavata pore kot dinamične
strukture, ki se lahko s časom širijo in krčijo. Velikost
por je pomembna, kadar želimo proučevati, katere
molekule in v kakšni količini bi lahko prehajale
membrano pri elektroporaciji s pulzi različnih dolžin.
Znano je namreč, da nanosekundni pulzi povzročijo
nastanek manjših por, ki v glavnem omogočajo prehod
le molekulam, katerih premer je manjši od ~1 nm [24].
V tem primeru za opis elektroporacije povsem zadostuje
asimptotični model [25]. Nasprotno lahko s pulzi v
območju več sto mikrosekund ali nekaj milisekund
vnesemo v celice tudi velike molekule DNA [21,26]. Za
korektno modeliranje transporta velikih molekul
moramo nujno uporabiti modele, ki zajemajo dinamiko
velikosti por. Omenimo še, da je bilo eksperimentalno
pokazano, da je mogoče molekule RNA vnesti v lipidne
vezikle tudi s pulzi dolžine 10 ns [27]. Povzamemo
lahko, da je pri modeliranju transporta velikih molekul
tako rekoč nujna uporaba enačbe Smoluchowskega ali
razširjenega asimptotičnega modela, ne glede na dolžino
obravnavanih pulzov.
3 MODEL TRANSPORTA MOLEKUL
Oglejmo si zdaj še princip modeliranja molekularnega
transporta. Gibanje molekul kot posledico
koncentracijskega gradienta in elektroforetske sile
običajno opišemo z Nernst-Planckovo enačbo:
e s
s s
q z cc
J D c V
t kT
  
       
  
. (9)
Pri tem je c koncentracija molekul, Ds difuzijska
konstanta molekul, qe in zs sta elementarni naboj in
naboj molekule, V pa je električni potencial.
Enačba (9) opisuje prosto gibanje molekul v
prostoru. Za opis transporta prek membrane pa lahko
privzamemo nekaj poenostavitev. Ker je membrana zelo
tanka (~5 nm), lahko predpostavimo, da transport prek
membrane poteka le pravokotno na membrano. Zaradi
tanke membrane lahko znotraj membrane
predpostavimo tudi kvazistatičnost enačbe (9); velja
torej c/t = 0. Ta predpostavka je upravičena, saj se
koncentracija molekul znotraj membrane zelo hitro
uravnovesi (v nanosekundah) [28]. Če še gradient
električnega potenciala V zapišemo kot kvocient
transmembranske napetosti Um in debeline membrane
dm, se izraz za pretok molekul Js poenostavi v:
e s m
s s
m
q z c Uc
J D
x kT d
 
   
 
(10)
Z integracijo zgornje enačbe dobimo rešitev:
0
e
0
e 1

 

 
 
 
m
m
i e
s m
m
s u
m i e
s mu
m
c c
D u
d
J
u c c
D u
d
, (11)
pri čemer je um brezdimenzionalna transmembranska
napetost, um = {qezs/(kT)}Um, ci in ce pa sta koncentraciji
molekul na notranji in zunanji strani membrane. Kadar
je membrana v elektroporiranem stanju bistveno dlje
(lahko tudi nekaj minut), kot traja samo dovajanje
pulzov, se večji del molekularnega transporta odvija po
dovajanju pulzov [29,30]. V tem primeru lahko
prispevek zaradi elektroforetske sile zanemarimo
oziroma privzamemo, da je um = 0.
Pretok molekul pa ne teče prek celotne membrane,
temveč le prek por v membrani. Najpreprostejši način,
kako Js omejimo zgolj na elektroporirano površino
68  REMS, MIKLAVČIČ
membrane, je, da Js množimo s skupnim deležem vseh
por v membrani Ap [28]. Ta delež zapišemo različno
glede na model elektroporacije, ki smo ga uporabili. Če
smo na primer uporabili enačbo Smoluchowskega, je
izraz za Ap enak
2
0
d



 p p p
m
A nr r
A
, (12a)
če smo uporabili razširjeni asimptotični model, pa
2
,

  p p j
jm
A r
A
, (12b)
kjer je Am površina membrane, ki jo opazujemo. Pri tem
smo predpostavili, da lahko najožji del notranjosti pore
opišemo s krogom, katerega radij je rp. Površina ene
pore, ki je na voljo za prehajanje molekule, je potem
določena kot rp
2
.
Pri množenju Js z Ap pa naletimo na omejitev. Ne
moremo namreč ločiti transporta večjih molekul od
transporta manjših. Z drugimi besedami, skupna
površina por je lahko enaka, če je v membrani bodisi
večje število manjših por bodisi manjše število večjih
por. Vemo pa, da molekule ne morejo prehajati skozi
pore, ki so manjše od njih samih [24,31].
Velikost molekul lahko upoštevamo s faktorjem
steričnega oviranja, H(rp,rs), ki je odvisen od radija por
rp in radija molekul rs. Eden od izrazov, s katerim ga
opišemo, je [25]:
2 3 5
1 1 2.1 2.09 0.95
         
             
          
          
s s s s
p p p p
r r r r
H
r r r r
(13)
Faktor H lahko zavzame vrednosti med 0 in 1; manjša je
pora, manjši je H (molekule težje prehajajo skozi
manjše pore), ter manjša je molekula, večji je H (manjše
molekule laže prehajajo skozi pore).
Poleg faktorja H lahko v model dodamo faktor
K(rp,zs,Um), s katerim upoštevamo še naboj molekul.
Bolj nabite molekule namreč teže prehajajo  pore, saj je
energijsko neugodno, da nabit delec zaide v poro v
lipidni membrani. Ko je nabit delec prisoten v pori, se
namreč v stenah pore ustvarijo navidezni naboji
nasprotnega predznaka kot sam delec, in ga zato
odbijajo. Faktor K lahko zapišemo kot [16,18,25]:
0 0
0 0
0 0
e 1
e
 
 
 
 


 

 
m
m m
m
u
w u w u
um m
m m
K
w e u w e u
w u w u
, (14)
kjer je w0 Bornova energija (v enotah kT), potrebna za
postavitev iona na sredino pore,  pa je geometrijski
faktor, ki opisuje obliko pore. Tudi faktor K lahko
zavzame le vrednosti med 0 in 1.
Oba faktorja preprosto vnesemo v model z
množenjem izraza za Ap:
2
0
d
p p p
A nr KH r 

  , (15a)
2
,p p j
j
A r KH   . (15b)
Dodatne podrobnosti o modeliranju transporta molekul
prek elektroporirane membrane in o tem, kako lahko
upoštevamo tudi obliko molekul, pa najdemo v [17].
4 UPORABA MODELOV ELEKTROPORACIJE
Opisane modele elektroporacije lahko uporabimo za
načrtovanje novih eksperimentalnih protokolov ali za
interpretacijo pridobljenih eksperimentalnih rezultatov.
V nadaljevanju se bova omejila na dva konkretna
primera uporabe, in sicer za:
1. optimizacijo elektrozlivanja celic različnih
velikosti in
2. interpretacijo eksperimentalnih rezultatov, ki so
pokazali povečan vnos molekul v celice pri nižji
prevodnosti zunajceličnega medija.
4.1 Optimizacija elektrozlivanja celic različnih
velikosti
Elektrozlivanje je metoda, pri kateri z elektroporacijo
dosežemo, da se različne celice lahko zlijejo med sabo.
Nastanek por v membrani namreč povzroči, da celična
membrana postane fuzogena, tj. sposobna zlivanja z
drugo celično membrano. Če se torej dve celici z
elektroporiranima membranama nahajata v stiku, se
lahko zlijeta v eno celico (slika 2) [32].
Z zlivanjem običajno pridobivamo hibridne celice, ki
združujejo lastnosti starševskih celic, iz katerih so
nastale. Tako je mogoče hibridizirati rastline, ki
postanejo odporne na različne okoljske dejavnike [33],
pripraviti celična cepiva za stimulacijo imunskega
odziva pri zdravljenju raka [34] ter celice, ki proizvajajo
inzulin in jih lahko uporabimo pri raziskavah in
zdravljenju diabetesa [35]. Najbolj razširjen primer
zlivanja, ki si ga bomo v nadaljevanju tudi podrobneje
ogledali, pa je zlivanje limfocitov B in mielomskih celic
v t. i. hibridome, ki proizvajajo monoklonska protitelesa
[36].
Limfociti B so bele krvne celice, ki proizvajajo
posebne proteine, imenovane protitelesa, s katerimi
onesposobijo različne tuje/sovražne celice v našem
telesu. Vsak limfocit B proizvaja le en tip protiteles,
medtem ko več limfocitov B lahko proizvaja isti tip
protiteles. Vsako protitelo pa ima specifično vezavno
mesto za natančno določen antigen (na primer molekulo
RAZLIČNI MODELI ELEKTROPORACIJE IN TRANSPORTA MOLEKUL PREK CELIČNE MEMBRANE 69
v membrani bakterije ali virusa). Ko se protitelo veže na
ta antigen, ga s svojo vezavo onesposobi ali ga označi
za napad s strani celic imunskega sistema.
Kadar imunski sistem ne zmore prepoznati sovražnih
celic v telesu (npr. pri raku), ali napačno prepozna
lastne celice kot sovražne (pri avtoimunskih boleznih),
lahko imunski sistem stimuliramo oz. zavremo z
vnosom ustreznih protiteles v krvni obtok. Takšna
zdravila, ki spadajo med biološka, veljajo za eno
najobetavnejših strategij pri zdravljenju določenih vrst
raka, avtoimunskih in infekcijskih boleznih [37–39].
Protitelesa zaradi svoje specifične vezave na točno
določen antigen lahko uporabimo tudi za detekcijo
različnih molekul. Tako imenovani imunski testi (ang.
immunoassay) se med drugim uporabljajo pri
ugotavljanju nosečnosti, alergij in različnih okužb (HIV,
hepatitis, malarija, tuberkuloza idr.). Poleg uporabe v
medicini pa so imunski testi že desetletja nepogrešljivo
orodje pri raziskavah v biologiji, biotehnologiji,
biokemiji, farmaciji in drugih sorodnih vedah [40,41].
Kot je bilo že rečeno, so osnovni vir protiteles
limfociti B. Žal samih limfocitov B ne moremo gojiti
zunaj njihovega naravnega okolja, saj odmrejo po nekaj
delitvah. Če pa jih zlijemo z mielomskimi celicami
(rakavimi limfociti), ki so nesmrtne, pridobimo zlite
celice (hibridome), ki jih lahko leta uporabljamo za
pridobivanje določenih protiteles. Ker vsa protitelesa
prihajajo iz enega klona zlitih celic, jih imenujemo
monoklonska protitelesa, celotno tehnologijo tako
pridobljenih protiteles pa hibridomna tehnologija.
Konvencionalna metoda zlivanja v hibridomni
tehnologiji je sicer uporaba polietilen glikola, vendar se
je elektrozlivanje izkazalo za učinkovitejše glede števila
pridobljenih hibridomov [42]. Žal pa ima tudi
elektrozlivanje svoje omejitve, saj je obsežnost
elektroporacije celične membrane sorazmerna z
velikostjo celic, limfociti B pa so približno dvakrat
manjši od mielomskih celic. Če torej limfocite B in
mielomske celice hkrati izpostavimo električnim
pulzom, ki zagotovijo elektroporacijo limfocitov B,
lahko ti pulzi ireverzibilno elektroporirajo mielomske
celice [36]. Tako je tudi število preživelih hibridomov
zelo majhno. V najboljšem primeru dosežemo največ
~1 % hibridomov na število uporabljenih limfocitov B
[42,43].
Običajno se za elektrozlivanje uporabljajo električni
pulzi z dolžinami v območju od 10–100 s. Z uporabo
numeričnega modeliranja pa smo ugotovili, da lahko s
skrajšanjem dolžine pulzov v območje nanosekund
omejimo elektroporacijo le na območje stika med
celicami, torej le tam, kjer je to potrebno za
elektrozlivanje (Slika 3) [44]. Načeloma pri tem ne
poškodujemo nobene od celic, ne glede na njihovo
velikost, s tem pa lahko izboljšamo število pridobljenih
hibridomov.
Model, s katerim smo prišli do opisanih ugotovitev,
je temeljil na asimptotičnem modelu elektroporacije.
Ker vemo, da je temeljni pogoj za elektrozlivanje
elektroporacija celičnih membran na območju stika med
celicami [32], je ta model zadostoval za raziskovanje
možnosti elektrozlivanja celic z različnimi parametri
električnih pulzov. Na podlagi primerjave rezultatov
elektrozlivanja celic mišjih melanomov B16-F1 z
napovedmi  numeričnega modela pa smo ugotovili, da
Slika 2: Osnovni postopek elektrozlivanja celic. (a) Komora za
zlivanje celic (Eppendorf). (b,c) Mikroskopske slike
svetlobnega polja pri povečavi 20. Črno območje zgoraj in
spodaj so elektrode. Med elektrodama so celice mišjih
melanomov B16-F1. (b) Celice najprej dielektroforetsko
uredimo v verige z izmeničnim sinusnim električnim signalom
(tukaj 2 MHz, 5 Vpp, 30 s). Potem jih izpostavimo
elektroporacijskim pulzom (tukaj 20 pravokotnih pulzov
100 ns, 180 V, ponavljalna frekvenca 1 kHz) in nato ponovno
dielektroforetskemu signalu, da celice ostanejo v stiku in se
lahko zlijejo. (c) Celice 8 minut po dovajanju pulzov. Nekaj
zlitih celic je označenih s puščicami.
70  REMS, MIKLAVČIČ
se model dobro ujema z eksperimentalnimi rezultati
[44].
Slika 3: Primerjava elektroporacije dveh različnih celic v stiku
z 10 s in 100 ns pravokotnim pulzom [44]. Znotraj celic se
nahajajo še celična jedra. Elektroporirano območje membran
je označeno odebeljeno. 10 s pulz povzroči obsežno
elektroporacijo velike celice, kar celico lahko poškoduje do te
mere, da ne preživi. 100 ns pulz nasprotno povzroči samo
elektroporacijo stika med celicami. Teoretično lahko torej z
nanosekundnim pulzom dosežemo elektrozlivanje, ne da bi
poškodovali katerokoli od celic.
4.2 Povečan vnos molekul v celice pri nižji
prevodnosti zunajceličnega medija
Z električnega stališča ima celična membrana zelo nizko
prevodnost v nasprotju z zunajceličnim medijem in
notranjostjo celice (citoplazme), ki sta zaradi visoke
vsebnosti ionov razmeroma dobro prevodni. Hkrati je
celična membrana zgrajena iz lipidov in proteinov in
ima zato nizko relativno dielektričnost (~5). Celico tako
lahko poenostavljeno obravnavamo kot vase sklenjen
kondenzator.
Pri izpostavitvi električnemu pulzu se celična
membrana (kondenzator) naelektri prek upornosti
zunajceličnega medija in citoplazme. V mediju z višjo
upornostjo (nižjo prevodnostjo) se bo membrana
naelektrila počasneje, obenem pa bo tudi najvišja
dosežena transmembranska napetost nekoliko nižja, saj
del napetosti, kateri izpostavimo celice, pade že na
upornosti zunajceličnega medija [45].
V razdelku 2 smo prikazali, da je nastajanje por
eksponentno odvisno od kvadrata transmembranske
napetosti Um. Povsem upravičeno bi potem pričakovali,
da bo celična membrana v niže prevodnem mediju manj
elektroporirana in da bo transport molekul prek
membrane posledično manjši. Vendar nekateri poskusi
kažejo drugače.
Djuzenova in sodelavci so pokazali, da se je količina
vnesenih molekul propidijevega jodida v celice
monotono povečevala, če so prevodnost zunajceličnega
medija znižali iz ~0.5 S/m na ~0.1 S/m [46]. Pri tem so
celice izpostavili eksponentno padajočemu pulzu s
časovno konstanto 40 s, ki je povzročil maksimalno
amplitudo električne poljske jakosti od 0.7 do 6 kV/cm.
Podobno so pokazali Müller in sodelavci, le da so celice
izpostavili pravokotnemu pulzu z dolžino od 11 do
95 ns, ki je povzročil električno poljsko jakost od 40 do
160 kV/cm [47]. Rezultati Sadika in sodelavcev so bili v
skladu z zgornjimi raziskavami, pri čemer so ti uporabili
zunajcelični medij s prevodnostjo od 0.2 do 0.01 S/m ter
pravokotni pulz z dolžino 100 ms z amplitudo
0.8 kV/cm [48].
Kako torej razložiti povečan vnos propidijevega
jodida? Müller in sodelavci so predlagali
elektrodeformacijo kot odgovorni mehanizem. V mediju
z nižjo prevodnostjo se celice podaljšajo v smeri
električnega polja, kar naj bi povzročilo obsežnejšo
elektroporacijo celic [47]. Teoretična študija, ki so jo
naredili Li in sodelavci, pa je predlagala drug
mehanizem [49]. Njihov model, ki je temeljil na
razširjenem asimptotskem modelu elektroporacije in
modelu transporta molekul po Nernst-Planckovi enačbi,
je pokazal naslednje. V zunajceličnem mediju z nižjo
prevodnostjo je električno polje v neposredni okolici
celice večje kot v mediju z višjo prevodnostjo.
Elektroforetska sila, ki med prisotnostjo električnega
pulza vleče molekule propidijevega jodida v celico, je
potem v niže prevodnem mediju večja, zato je tudi vnos
molekul v niže prevodnem mediju večji.
Pri tem je seveda treba predpostaviti, da je večina
molekul vnesena v celico elektroforetsko že med samim
pulzom, difuzija molekul po pulzu pa manj pripomore k
celotnemu transportu. To se sicer sklada z
eksperimentalnimi rezultati Sadika in sodelavcev [48],
ne pa z rezultati Puciharja in sodelavcev [30]. Ti so
pokazali, da je vnos molekul propidijevega jodida med
samim pulzom zanemarljiv v primerjavi z vnosom po
pulzu. Razlog za nesoglasje med omenjenima
eksperimentalnima raziskavama bi lahko bil v
uporabljeni dolžini električnega pulza. Pucihar in
sodelavci so uporabili pulz z dolžino 1 ms, medtem ko
so Sadik in sodelavci uporabili bistveno daljši pulz,
100 ms. Pri daljšem pulzu je elektroforetska sila
prisotna dlje, zato je tudi elektroforetski prispevek
transporta molekul večji. Morda še pomembnejši razlog
za nesoglasje pa je razlika v času celjenja celičnih
membran po izpostavitvi pulzu (poskusi so bili narejeni
na celicah različnega tipa). Iz eksperimentalnih
rezultatov lahko razberemo, da je bil čas celjenja pri
poskusu Puciharja in sodelavcev daljši od 8 s, medtem
ko se je pri poskusu Sadika in sodelavcev končal po
približno 1.5 s. Daljši čas celjenja membran omogoča,
da difuzno gibanje molekul poteka še dolgo po pulzu,
RAZLIČNI MODELI ELEKTROPORACIJE IN TRANSPORTA MOLEKUL PREK CELIČNE MEMBRANE 71
prispevek vnesenih molekul zaradi difuzije pa prevlada
nad prispevkom zaradi elektroforeze.
Zgoraj opisani primer nazorno prikaže, kako sočasno
modeliranje elektroporacije in transporta molekul lahko
razloži določen pojav na način, do katerega ne moremo
priti zgolj intuitivno. Obenem pa opisano nesoglasje v
raziskavah nakaže na dejstvo, da modeli elektroporacije
in transporta molekul še zdaleč niso razviti do te mere,
da bi lahko razložili vse, kar nam kažejo poskusi [50].
5 SKLEP
Modeliranje elektroporacije je poseben izziv, saj pojav
še vedno ni povsem razumljen [50]. Ker por v
membrani ne moremo neposredno opazovati v realnem
času, jih lahko proučujemo le posredno prek
molekularnega transporta, meritev transmembranske
napetosti in prevodnosti membrane [1,19]. V zadnjem
desetletju so k razumevanju elektroporacije močno
pripomogle simulacije molekularne dinamike, vendar so
te računsko zelo zahtevne. Zato smo pri simulacijah
omejeni na opazovanje majhnega koščka membrane
(reda 100 nm
2
), katerega gibanje lahko spremljamo do
nekaj 100 ns po izpostavitvi električnemu polju [9,10].
Čeprav simulacije ponujajo nepogrešljiv vpogled v
dogajanje na molekularni ravni, trenutno še ne morejo
ponuditi odgovorov na vsa vprašanja. Ne nazadnje pa se
je treba zavedati, da so lipidni dvosloji, ki jih
opazujemo v simulacijah, bistveno preprostejši od
celičnih membran. Še vedno ni povsem znano, v
kolikšni meri in na kakšen način pri elektroporaciji
sodelujejo druge membranske strukture, kot so
membranski proteini in citoskelet.
Posebna uganka elektroporacije pa je pravzaprav
celjenje membran po dovajanju električnih pulzov.
Simulacije molekularne dinamike kažejo, da se pore po
umaknitvi transmembranske napetosti zaprejo v nekaj
nanosekundah [10], celice pa lahko ostanejo
elektroporirane tudi več minut [50]. V prejšnjem
razdelku smo omenili, da ima časovna konstanta
celjenja celičnih membran pomembno vlogo predvsem
pri transportu molekul, saj je lahko bistveno daljša od
trajanja samih pulzov in se zato lahko večina transporta
odvije po dovajanju pulzov.
Fizikalne razlage za dolgotrajno celjenje membran po
elektroporaciji še ni na voljo. V modele ga lahko
dodamo »umetno«, tako da v enačbah spreminjamo
vrednosti parametrov, ki opisujejo celjenje, ali
obstoječim enačbam dodamo izraz, ki povzema
eksperimentalne rezultate [18,23]. Za mehanistični opis
celjenja celične membrane so torej potrebni nadaljnje
raziskave in razvoj modelov.
Dokler pa novejših in bolj izpopolnjenih modelov
elektroporacije ni na voljo, si moramo pomagati z
obstoječimi. Kateri model bomo izbrali, je odvisno od
namena njegove uporabe. Posebej pozorni moramo biti
pri obravnavi transporta velikih molekul, saj
potrebujemo informacijo o velikosti por, če želimo
napovedati, ali bodo molekule sploh lahko prehajale
membrano. Zaradi zahtevnosti numerične
implementacije in računske zahtevnosti modelov, ki
opisujejo dinamiko velikosti por, pa je smiselno
premisliti, ali za svojo raziskavo res potrebujemo tako
kompleksen model. V določenih primerih ponujata
asimptotični model in model po reakcijski shemi
povsem zadovoljive rezultate [18,22,23,25,44].
ZAHVALA
Raziskave je podprla Javna agencija za raziskovalno
dejavnost Republike Slovenije (ARRS) v okviru
programov P2-0249 in IP-0510 ter financiranja za
mladega raziskovalca 35414. Raziskave so bile
izvedene pod okriljem Evropskega laboratorija za
aplikacije pulznih električnih polj v biologiji in medicini
(LEA EBAM).