1 UVOD
Z difuzno reflektančno spektroskopijo (DRS, ang.
diffuse reflectance spectroscopy) analiziramo svetlobo,
ki se izseva iz sipajočega medija, osvetljenega s
širokospektralnim svetilom. Narava širjenja svetlobe v
sipajočem mediju je odvisna od njegovih kemijskih in
morfoloških lastnosti, zato se v izsevani svetlobi nahaja
informacija o sestavi opazovanega vzorca. Posledično
lahko z DRS-jem neinvazivno ocenjujemo lastnosti
vzorcev na področju biomedicine [1], živilske
industrije [2], farmacije [3] in kmetijstva [4].
V biomedicini so vzorci povečini človeška in
živalska tkiva, ki jim s posebnimi metodami določamo
optične lastnosti [5]. Najpogosteje uporabljeni optični
lastnosti tkiv sta koeficienta absorpcije (µa) in sipanja
(µs), pri čemer µa·ds in µs·ds predstavljata verjetnosti, da
se foton v infinitezimalni razdalji ds bodisi absorbira ali
siplje. Obratni vrednosti koeficientov sta povprečni
prosti poti za dogodek absorpcije 1/µa ali sipanja 1/µs.
Namesto koeficienta sipanja v spektroskopiji po navadi
merimo zmanjšani koeficient sipanja )1( g
ss
  ,
kjer je g faktor anizotropije. Vrednost faktorja
anizotropije v tkivih znaša 0,7 in 0,99, kar kaže na
prevladujoče sipanje v smeri vpadne svetlobe (ang.
forward scattering).
Prejet 7. januar, 2016
Odobren 25. marec, 2016
94  CUGMAS, NAGLIČ
Čeprav velja DRS za neinvazivno metodo, je na
področju humane in veterinarske medicine izvajanje
poskusov in vivo velikokrat neprimerno zaradi etičnih in
moralnih razlogov. Temu se lahko izognemo, če
človeška in živalska tkiva nadomestimo z laže
dostopnimi vzorci (t.i. fantomi), ki imajo podobne
lastnosti kot proučevana tkiva. Po navadi se fantomi
uporabljajo (1) za bazična testiranja nove optične
tehnike, (2) za optimizacijo razmerja signal-šum, (3) za
ocenjevanje ponovljivosti tehnike in (4) za primerjavo
različnih tehnik med seboj [6].
Želimo si, da bi bile lastnosti fantomov identične
proučevanemu biološkemu tkivu, a tega v praksi ni
mogoče doseči. Po navadi od fantomov zahtevamo vsaj
podobne koeficiente absorpcije in sipanja, kar lahko na
primer dosežemo z uporabo sorodnih živalskih tkiv, ki
jih kupimo v mesnici. Ta tkiva nato uporabimo pri
poskusih ex vivo. Seveda je pri tem treba paziti na
ustrezno shranjevanje fantomov, saj to vpliva na njihove
optične lastnosti [7]. Dodatna slabost takega pristopa je,
da fantomom ne moremo nadzorovati ali jim spreminjati
optičnih lastnosti. To težavo odpravimo z uporabo
sintetičnih fantomov, ki imajo znan koeficient
absorpcije in sipanja. Za absorberje (tj. snovi z visokim
µa in zanemarljivim µs) se največkrat uporabljajo črnila
(ang. molecular dye inks, India inks) in hemoglobin, za
sipalce (tj. snovi z visokim µs in z zanemarljivim µa) pa
lipidi, polistirenske sfere in titanijev dioksid [6].
Mešamo jih v vodo, želatino ali silikon, ciljne optične
lastnosti pa zlahka dosegamo z ustreznimi
kombinacijami in koncentracijami posameznih
komponent.
V nedavni študiji smo pokazali, da je treba poleg
optičnih lastnosti pri pripravi fantomov upoštevati tudi
njihove mehanske lastnosti [8]. Te namreč določajo
dinamiko kontaktnega pritiska, ki ga prek optične sonde
na tkivo aplicira operater. Menimo, da bi idealen fantom
moral poleg optičnih posnemati tudi mehanske lastnosti
biološkega tkiva. Pri pripravi fantomov se prav tako
soočamo z vprašanjem, kakšna je njihova obstojnost v
daljšem časovnem obdobju. Glede na izkušnje vemo, da
od fantomov, ki vsebujejo organske snovi, kot so lipidi
[9] in hemoglobin, ne moremo pričakovati dolge
obstojnosti. Nasprotno pa je pri anorganskih snoveh
(npr. TiO2) obstojnost daljša.
V literaturi ni veliko študij, ki bi kvantitativno
vrednotile obstojnost pogosto uporabljenih absorberjev
in sipalcev. Ninni idr. [10] so merili razlike v
koeficientih absorpcije črnil »India ink« iz različnih
proizvodnih serij. Ugotovili so, da je koeficient
absorpcije črnila zelo variabilen pri istem in tudi med
različnimi proizvajalci. Dodatno so avtorji merili
obstojnost črnila. Izkazalo se je, da so spremembe v 275
dneh znotraj 2,4 %. Isti avtorji so podobno študijo
opravili tudi na emulziji Intralipid® [9]. Ugotovili so,
da emulzija več let ne spremeni koeficienta sipanja, kar
jo naredi izjemno praktično za izdelavo ponovljivih
fantomov.
Zaradi pomanjkanja študij o obstojnosti absorberjev
smo izvedli poskus, ki je trajal dva meseca. Ta je
simuliral rutinsko laboratorijsko merjenje optičnih
lastnosti vzorcev z DRS-jem. Pri tem se pogosto
sprašujemo, kako in kje hraniti fantome v času meritev,
da bodo v daljšem časovnem obdobju ohranili optične
lastnosti. Osredotočili smo se na črnila za nalivna
peresa, ki so poceni in dostopna. V nasprotju s črnili
»India ink«  črnila za nalivna peresa vsebujejo zgolj
molekularne absorberje, s čimer je njihova komponenta
sipanja zanemarljiva, kar prek prepustnosti omogoča
preprosto meritev absorpcijskega koeficienta. Kot smo
omenili, ni znano, kako se µa spreminja s časom glede
na različne vplive iz okolice. Če iščemo vzporednice z
barvili za tiskalnike [11], lahko sklepamo, da tudi na
proučevana črnila vplivajo svetloba, ozon, voda in
toplota. V študiji smo preverili, kako se učinkovitost
absorberjev v različnih črnilih spreminja v odvisnosti od
časa in mesta hrambe fantomov.
2 MATERIALI IN METODE
2.1 Črnila
Uporabili smo absorberje v devetih črnilih petih
različnih proizvajalcev:
1. rdeče (Pelikan 4001, 78-09, Brilliant Red),
2. modro (Pelikan 4001, 78-04, Royal Blue),
3. črno (Online 17016, Black),
4. zeleno (Live Line, Zelena),
5. rdeče (Live Line, Rdeča),
6. črno (Live Line, Črna),
7. črno (M&M 698701),
8. modro (Brause 97202),
9. rdeče (Brause 97208) črnilo.
Vsako črnilo smo pripravili v vodni raztopini (s
prečiščeno oz. deionizirano vodo) v dveh različnih
koncentracijah, s čimer smo skupaj dobili 18 vzorcev
absorberjev z vrednostmi µa med 0,2 in 1,5 cm
-1
.
2.2 Merilna oprema
Pripravljenim raztopinam smo merili prepustnost v
vidnem območju valovnih dolžin med 400 in 900 nm.
Svetlobo, ki jo je zagotavljala širokospektralna
halogenska luč (AvaLight-Hal LS, Avantes,
Nizozemska), smo prek optičnega vlakna dovajali v
merilni nastavek za kivete (CUV-UV/VIS-ACC-
0504013, Avantes). Pri meritvah smo uporabljali 1 cm
široke kivete (PMMA, 2,5 ml, 7591-05, Brand Gmbh,
Nemčija). Prepuščeno svetlobo smo nato zajeli s
spektrometrom AvaSpec-2048-TEC-TF (Avantes).
Obsevanost fantomov z umetno svetlobo smo izmerili s
spektroradiometrom Jeti Specbos 1200 (JETI
Technische Instrumente GmbH, Nemčija).
2.3 Meritve
Najprej smo vsem 18 raztopinam izmerili prepustnost
(tj. skupina Tema ob času t0). Nato smo vsak vzorec
absorberjev razdelili na tri dele in jih ločeno shranili v
OBSTOJNOST ČRNIL V VODNIH FANTOMIH ZA UPORABO Z DIFUZNO REFLEKTANČNO SPEKTROSKOPIJO 95
nepredušno zaprte plastične epruvete. Tako smo dobili
tri enake skupine po 18 vzorcev. Prvo skupino epruvet
smo hranili v temi (kontrolna skupina Tema), drugo v
sobi z okni, a zunaj dosega neposredne sončne svetlobe
(skupina Soba), tretjo pa na okenski polici v sobi in na
neposrednem dosegu sončne svetlobe (skupina Sonce).
Glede na meritve Agencije Republike Slovenije za
okolje (ARSO) [12], je skupna prejeta sončna energija
za skupino Sonce znašala 100,26 kWh/m
2
, za skupino
Soba pa 46,80 kWh/m
2
. Umetno svetlobo so
zagotavljale žarnice Osram he14w/830. Skupina Soba je
prejela 158,4 Wh/m
2
obsevanja, skupina Sonce pa
450,6 Wh/m
2
. Površina vzorcev je merila 6,81·10
-4
m
2
.
Vzorci so bili hranjeni na sobni temperaturi v razponu
med 18,1 in 24,0 °C.
Prepustnost vseh vzorcev smo merili še dvakrat, po
enem (čas t1) in po dveh mesecih (čas t2). Pred vsako
meritvijo smo s tehtnico preverili ustreznost teže vzorca
in s tem odkrivali potencialno izparevanje vode. Takoj
po meritvah smo vzorce vrnili na prvotna mesta (Tema,
Soba in Sonce). Povprečna masa vseh vzorcev (54
vzorcev) je znašala 5,86 g (standardna deviacija σ =
0,99 g). V povprečju se je masa po enem mesecu (t1)
zmanjšala za 1,36 % (σ = 0,45 %), po dveh mesecih (t2)
pa za 2,78 % (σ = 0,67 %).
2.4 Izračuni
Prepustnost vzorca v odvisnosti od valovne dolžine T(λ)
izračunamo z razmerjem med svetlobnim signalom
vzorca Svzorec, ko se v kiveti nahaja vzorec črnila, in
svetlobnim signalom Svoda, ko se v kiveti nahaja
deionizirana voda:
)()(
)()(
)(



DS
DS
T
voda
vzorec


 . (1)
V zgornji enačbi smo svetlobna signala popravili s
temnim tokom detektorja v spektrometru D(λ). Tako
dobimo pravo prepustnosti vzorca v vidnem
spektralnem območju, saj ima voda kot referenčni medij
v tem območju zanemarljivo absorpcijo, hkrati pa isti
lomni količnik kot raztopine z absorberji črnila.
Prepustnost (T) smo nato pretvorili v absorbanco (A):
)(log)(
10
 TA  . (2)
Iz absorbance smo izračunali dva parametra, ki
opisujeta učinkovitost absorberjev črnil. Najprej smo s
poznavanjem optične poti v kiveti (1 cm) izračunali
koeficient absorpcije µa dominantnega absorpcijskega
vrha (nekatera črnila so imela namreč več absorpcijskih
vrhov, saj so vsebovala več komponent). Nato smo
izračunali tudi celotno absorbanco (Acel) v intervalu med
400 in 900 nm:

nm
nm
cel
dAA
900
400
)(  . (3)
V nadaljevanju smo koeficient absorpcije (µa) in
celotno absorpcijo (Acel) vsakega vzorca normirali glede
na meritve pri času t0:
},{,
)(
)(
)(
21
0
,
ttt
t
t
t
a
a
norma



 , (4)
},{,
)(
)(
)(
21
0
,
ttt
tA
tA
tA
celotna
celotna
normcel
 . (5)
Skupine vzorcev smo med seboj primerjali s testom
Wilcoxon Rank Sum. Statistično signifikantna razlika
med skupinama je obstajala, če je bil p manjši ali enak
0,05.
3 REZULTATI
V študiji smo ocenjevali obstojnost absorberjev v črnilih
v odvisnosti od časa hranjenja in izpostavljenosti sončni
svetlobi. V tabeli 1 so zbrani povprečni normirani
koeficienti absorpcije (µa,norm) in celotne absorbance
(Acel,norm). V povprečju je celotna absorbanca vzorcev v
temi padla za 6,5 %, ne glede na čas merjenja. Po drugi
strani pa je neposredna sončna svetloba zmanjšala
celotno absorbanco za 16,7 % po enem in za 19,6 % po
dveh mesecih.
Tabela 1: Mediana in srednja vrednost normiranih
koeficientov absorpcije (µa,norm) in celotne absorbance
(Acel,norm) po enem (t1) in po dveh mesecih (t2).
Skupina
(čas)
Mediana
µa,norm
Sr. vred.
µa,norm
Mediana
Acel,norm
Sr. vred.
Acel,norm
Tema (t1) 96,7 % 93,0 % 97,0 % 93,5 %
Soba (t1) 97,5 % 85,0 % 97,4 % 87,9 %
Sonce (t1) 93,0 % 80,6 % 94,3 % 83,3 %
Tema (t2) 97,3 % 93,0 % 97,2 % 93,7 %
Soba (t2) 97,0 % 84,7 % 97,2 % 87,5 %
Sonce (t2) 91,7 % 78,8 % 90,7 % 80,4 %
V grafikonih kvartilov (sliki 1 in 2) so prikazani
normirani koeficienti absorpcije dominantnega vrha in
celotna absorbanca črnil. S statističnimi testi smo
preverjali predvsem razliko med skupinami, ki so ali
niso bile izpostavljene sončni svetlobi. Signifikantna
razlika je bila med skupinami Tema (t1) in Sonce (t2) (p
= 0,02 za µa in Acel),  Tema (t2) in Sonce (t2) (p = 0,02 za
µa in p = 0,03 za Acel) ter Soba (t2) in Sonce (t2) (p =
0,03 za µa).
96  CUGMAS, NAGLIČ
Slika 1: Normirani koeficienti absorpcije (µa,norm). Križci
predstavljajo osamelce (ang. outliers).
Slika 2: Normirana celotna absorbanca (Acel,norm). Križci
predstavljajo osamelce (ang. outliers).
Absorberji v črnilih so se po obstojnosti med seboj
močno razlikovali (tabela 2). Na primer, črnili 4 in 7 sta
izkazovali dobro obstojnost (slika 3), saj večjih padcev
absorpcijskih parametrov ni bilo mogoče zaznati. Po
drugi strani pa sta se črnili 1 in 2 (tabela 2, slika 4)
izkazali za slabo obstojni. Še posebej so izstopali
absorberji v črnilu 1, saj so po mesecu dni na
neposredni sončni svetlobi skoraj v celoti izgubili svojo
učinkovitost. Druga črnila so izkazovala delno izgubo
svoje učinkovitosti (slika 5).
Tabela 2: Normiran koeficient absorpcije (µa,norm) in
normirana celotna absorbanca (Acel,n) vseh črnil po enem (t1) in
po dveh mesecih (t2).
Skupina Tema
(t1)
Soba
(t1)
Sonce
(t1)
Tema
(t2)
Soba
(t2)
Sonce
(t2) Črnilo
1
µa,norm 81,4 6,6 0,0 77,9 2,3 0,0
Acel,n 87,1 32,4 19,2 86,6 27,3 20,7
2
µa,norm 80,2 80,3 68,8 81,6 82,1 64,6
Acel,n 78,8 78,9 70,5 81,5 81,2 64,4
3
µa,norm 96,2 96,0 95,3 96,9 96,5 93,9
Acel,n 96,8 97,2 96,5 97,7 96,8 94,2
4
µa,norm 98,9 99,3 99,0 99,4 99,9 98,7
Acel,n 99,2 99,0 98,8 99,4 100 100
5
µa,norm 90,3 90,9 88,4 90,8 90,9 85,2
Acel,n 88,6 89,1 89,6 89,3 88,3 84,2
6
µa,norm 97,7 98,4 90,4 98,0 99,2 87,7
Acel,n 97,3 97,7 92,7 98,2 100 90,9
7
µa,norm 97,2 97,5 96,0 97,8 97,1 95,0
Acel,n 97,9 99,9 96,7 98,7 97,8 95,3
8
µa,norm 98,1 96,4 94,3 96,4 96,6 92,3
Acel,n 98,9 95,9 88,3 93,2 96,6 80,2
9
µa,norm 97,0 99,2 92,9 98,2 97,9 92,0
Acel,n 97,0 100 97,4 98,9 97,8 92,4
Slika 3: Absorpcijski koeficient črnila 4. (Tema (t0) je
kontrolna skupina ob začetku poskusa.)
Slika 4: Absorpcijski koeficient črnila 1. (Tema (t0) je
kontrolna skupina ob začetku poskusa.)
Slika 5: Absorpcijski koeficient črnila 6. (Tema (t0) je
kontrolna skupina ob začetku poskusa.)
OBSTOJNOST ČRNIL V VODNIH FANTOMIH ZA UPORABO Z DIFUZNO REFLEKTANČNO SPEKTROSKOPIJO 97
4  RAZPRAVA
Meritve absorpcijskih parametrov črnil so bile
opravljene v kivetah iz transparentnega akrilnega stekla
(polimetilmetakrilat, PMMA), ki so bile trdno
nameščene v posebnem nastavku. Med merjenjem
svetlobnih signalov Svoda smo zaznali variacijo
prepustnosti, za kar so verjetno odgovorne razlike v
sestavi in položaju kivet. Z dodatnimi meritvami smo
ocenili, da lahko omenjene ugotovitve vplivajo na
končne rezultate absorpcijskih parametrov (µa,norm,
Acel,norm) do 1 odstotne točke.
Rezultati (tabela 1) so pokazali, da v povprečju
absorberji v črnilih s časom izgubljajo svojo
učinkovitost absorpcije vidne svetlobe. V povprečju sta
se koeficient absorpcije dominantnega vrha in celotna
absorbanca črnil po enem mesecu v temi zmanjšala za
7 %. V nasprotju z omenjenim pojavom pa po dveh
mesecih nadaljnjega upadanja parametrov absorpcije ni
bilo mogoče zaznati. Glede na to, da omenjeni vzorci
niso bili izpostavljeni svetlobi, sklepamo, da so za
manjše vrednosti parametrov absorpcije krivi drugi
okoljski dejavniki. Mednje spada redčenje s prečiščeno
oz. deionizirano vodo, zaradi česar se je spremenila pH-
vrednost črnil in s tem njihov odtenek. Podoben pojav
opazimo pri uporabi črnil kot pH indikatorjev [13], ki
ob prehodu pH spremenijo svojo barvo. Uporabljena
črnila imajo namreč kontrolirane pH-vrednosti, ki se
nahajajo v kislem (npr. pH 2,7 pri črnilu 2) ali bazičnem
območju (npr. pH 7,5 pri črnilu 1) (lastne meritve).
Dodatno lahko spremenjena pH vrednost vodi do
konformacijskih sprememb molekul absorberja. Zaradi
narave meritev seveda ne moremo izključiti tudi drugih
dejavnikov, ki vplivajo na spremembe v absorpciji.
Rezultati preostalih dveh skupin (Soba, Sonce) so
pokazali, da sončna svetloba dodatno zmanjša
učinkovitost absorberjev v črnilih. Če je vzorec
izpostavljen posredni sončni svetlobi (skupina Soba), se
koeficient absorpcije v enem mesecu dodatno zmanjša
za 8 odstotnih točk glede na skupino Tema, če pa je
črnilo neposredno na sončni svetlobi, se koeficient
absorpcije v poprečju zmanjša za dodatnih 12 odstotnih
točk (tabela 1).
V nadaljevanju poskusa se učinkovitost absorberjev
črnil bistveno ne zmanjšuje več. Takšni rezultati
nakazujejo na več-komponentno sestavo črnil, pri čemer
so posamezne komponente (tj. absorberji) različno
občutljive na sončno svetlobo. Našo domnevo nam
potrdi opazovanje absorpcijskega koeficienta črnila 1
(slika 4), kjer opazimo dva absorpcijska vrhova, ki sta
posledica dveh komponent črnila. Dominantni vrh se
nahaja pri 527 nm, drugi pa pri 426 nm. S časom in
izpostavljenostjo sončni svetlobi se dominantni vrh
izrazito manjša, drugi pa zanemarljivo.
Na primeru črnila 1 lahko pojasnimo, zakaj smo za
ocenjevanje učinkovitosti absorpcije črnil uporabili dva
parametra, tj. koeficient absorpcije dominantnega vrha
in celotno absorbanco. Koeficient absorpcije
dominantnega vrha je s časom in svetlobo padel na 0
(slika 4), a pri ostalih valovnih dolžinah ostale
komponente niso v celoti izgubile svoje učinkovitosti.
Menimo, da je koeficient absorpcije soliden opis
učinkovitosti absorberjev v eno-komponentnih črnilih,
medtem ko celotna absorbanca bolje opisuje več-
komponentna črnila (npr. črnilo 1).
Črnili 1 in 2 sta se v naši študiji izkazali za najmanj
obstojni. Obema je s časom in izpostavljenostjo sončni
svetlobi padala učinkovitost absorpcije. Zanimivo je, da
sta obe črnili od istega proizvajalca (Pelikan). Rezultati
nas opozarjajo, da moramo biti pri izbiri črnil za
fantome previdni, saj so nekatera zelo neobstojna ne
samo na svetlobi, ampak tudi v sami vodni raztopini.
Kot vidimo v tabeli 2, je koeficient absorpcije
dominantnemu vrhu črnila 1 kljub hrambi v temi v
dveh mesecih padel za 22,1 %. Zato je treba pri graditvi
fantomov izbirati črnila, ki so čim bolj neobčutljiva na
okoljske dejavnike, kot sta npr. izpostavljenost sončni
svetlobi in redčenje z vodo. V naši študiji sta se kot
takšni izkazali črnili 4 in 7, saj na koncu študije njuni
absorberji niso imeli znakov manjše učinkovitosti. Po
analogiji s črniloma 1 in 2 (isti proizvajalec) bi glede na
obstojnost črnila 4 pričakovali podobne rezultate tudi za
črnili 5 in 6 (kolekcija Live Line), a se jima je celotna
absorbanca (skupina Sonce) po dveh mesecih zmanjšala
za dobrih 12 % (slika 5).
5 ZAKLJUČEK
S študijo o obstojnosti absorberjev v črnilih smo skušali
zaznati in kvantificirati spremembe, ki nastanejo v
daljšem obdobju hrambe fantomov. Glavna motiva
študije sta bila: 1. ocenjevanje učinkovitosti absorberjev
v črnilih glede na dolžino in način hrambe in 2. izvedba
meritev na podoben način, kot je to praksa pri meritvah
fantomov z DRS-jem. Pri zadnjih se pogosto
sprašujemo, kako pravilno ravnati s fantomi in kakšno
je najprimernejše mesto hrambe, če meritve potekajo
več dni. Ugotovili smo, da se črnila različno odzivajo na
okoljske dejavnike (sončna svetloba, redčenje z vodo).
Tako obstajajo črnila, katerim se učinkovitost absorpcije
tako rekoč ne zmanjšuje, ter črnila, ki so zelo
neobstojna. Menimo, da bodo predstavljene ugotovitve
pripomogle h kakovostnejši graditvi fantomov z
molekularnimi absorberji.
ZAHVALA
Avtorja se zahvaljujeva prof. dr. Gregi Bizjaku s
Fakultete za elektrotehniko in Gregorju Vertačniku z
Agencije Republike Slovenije za okolje (ARSO) za
pomoč pri izvedbi meritev obsevanosti. Zahvala tudi
Ministrstvu za izobraževanje, znanost in šport
Republike Slovenije v okviru programa P2-0232 in
Javni agenciji za raziskovalno dejavnost Republike
Slovenije v okviru postdoktorskega projekta in
projektov L2-5472, J2-5473, J7-6781, J2-7211 in J2-
7118.
98  CUGMAS, NAGLIČ