1 UVOD 1.1 Kaj je elektroporacija Elektroporacija je pojav, ko visokonapetostni električni pulzi povečajo prepustnost celične membrane za molekule, ki je po navadi ne morejo prehajati [1]. Elektroporacija je reverzibilna, če si celice po pulzih opomorejo, in ireverzibilna, če je škoda prevelika in celice umrejo [2]. 1.2 Kje se uporablja Elektroporacijo uporabljamo v prehranski industriji [3], biotehnologiji [4], okoljski tehnologiji [5], pri čiščenju vode [6] in v medicini [7], [8]. Področja uporabe v medicini so elektrokemoterapija, netermično odstranjevanje tkiva z ireverzibilno elektroporacijo, genska terapija in vnos zdravilnih učinkovin skozi kožo. 2 MODELIRANJE ELEKTROPORACIJE Z uporabo matematičnih in fizikalnih zakonov pri modeliranju strnjeno opišemo biološke pojave, omogočimo razumevanje in napovedovanje odziva ter zmanjšamo obseg eksperimentalnega dela. Pri načrtovanju medicinskih posegov elektroporacije z modeliranjem porazdelitve električnega polja napovemo učinkovitost terapij [9], optimiziramo parametre električnih pulzov ter število in postavitev elektrod in razvijamo nove pristope k zdravljenju [10]. Elektroporacijo modeliramo na različnih ravneh: 1. Prejet 10. april, 2019 Odobren 13. junij, 2019 162 DERMOL-ČERNE, MIKLAVČIČ molekule lipidov, atomi in ioni, 2. lipidni dvosloj oz. celična membrana, 3. celice in 4. tkiva. Trenutno so modeli večinoma omejeni na eno raven, modelov na več ravneh pa je malo. 2.1 Modeli na ravni molekul Osnovni gradniki celične membrane so fosfolipidi. Obnašanje lipidov in drugih molekul pod vplivom električnega polja lahko ugotavljamo s simulacijami molekularne dinamike [11], [12], ki so zaradi računske zahtevnosti omejene na nekaj tisoč nanosekund in sto molekul lipidov. Raziskave molekularne dinamike predvidevajo, da zaradi električnega polja v lipidnem dvosloju nastanejo hidrofobne pore, ki se razvijejo v hidrofilne pore, pride pa tudi do oksidacije celične membrane in sprememb funkcij membranskih proteinov. Rezultati simulacij molekularne dinamike so bili potrjeni tudi v poskusih, v katerih so ugotovili, da lahko mala interferenčna ribonukleinska kislina (siRNK) v nekaj nanosekundah prečka celično membrano [13]. 2.2 Modeli na ravni lipidnih dvoslojev V polarnem topilu, kot je voda, se lipidi spontano uredijo v lipidni dvosloj. Modele elektroporacije lipidnih dvoslojev lahko razdelimo v dve skupini [14]. V prvi so deterministični elektromehanski (hidrodinamični, elastični, hidroelastični, viskoelastični) modeli, ki dvosloj obravnavajo kot elastično telo in ga opisujejo z zakoni elektrostatike. Druga skupina so stohastični modeli nastanka por. Temeljijo na energijskih enačbah, združuje pa jih enačba Smoluchowskega, ki opiše nastanek in dinamiko razvoja por. Neu in Krassowska sta jo poenostavila in omogočila njen relativno preprosti numerični izračun [15], vendar pa v njej predvidevata, da se velikost por med pulzom ne spreminja. Asimptotski model elektroporacije je torej primeren le za izračune pri kratkih nanosekundnih pulzih, pri daljših pulzih se namreč že širijo. Tudi širjenje por med elektroporacijo lahko modeliramo, a je računsko zahtevnejše, ker za vsako poro posebej rešujemo diferencialno enačbo spremembe premera v vsaki časovni točki [16]. Med energijske modele spada tudi model, ki nastanek por opiše s kinetično shemo prehajanja membrane med prepustnimi in neprepustnimi stanji [17]. Transport majhnih molekul skozi poro lahko opišemo z elektrodifuzijsko enačbo [18]. 2.3 Modeli na ravni posameznih celic Lipidni dvosloj je skupaj z membranskimi proteini osnova za nastanek biološke celice [19]. Biološka celica je v približku električno slabo prevodna membrana (dielektrik), ki je na obeh straneh obdana z elektrolitom (prevodnik). Na ravni celic obstajajo modeli različnih pojavov: vsiljene transmembranske napetosti, nastanka por, transporta, prepustnosti in električne prevodnosti celične membrane, smrti. Časovna in prostorska dinamika vsiljene transmembranske napetosti sta analitično rešljivi za preproste oblike osamljenih celic [20], [21], na splošno pa zahtevata numeričen izračun [22]. Ko je vsiljena transmembranska napetost znana, lahko opišemo nastanek por [15]. Celice lahko med drugim modeliramo z ekvivalentnim električnim vezjem [23]. Smrt in prepustnost celic v suspenziji lahko opišemo s statističnimi modeli [24]. V literaturi se pojavljajo štirje modeli prepustnosti celične membrane – simetrična in asimetrična sigmoida, Gompertzova krivulja in hiperbolični tangens [24]. Modelov celične smrti je več [25], večinoma izhajajo iz živilske industrije, kjer z njimi napovedujejo učinkovitost uničevanja patogenih organizmov z namenom pasterizacije in sterilizacije hrane. Električno prevodnost in prepustnost celične membrane lahko modeliramo kot dva ločena pojava [17]. Opišemo lahko tudi deformacijo celične membrane skupaj z elektroporacijo med dovajanjem električnih pulzov [26], [27]. Transport molekul v posamezno celico opišemo z elektrodifuzijsko enačbo skozi prepustno membrano [28]. S kinetičnimi shemami lahko poleg transporta molekul v celice opišemo tudi transport v celične organele, vezavo citostatikov na DNK in popravilo DNK ter eliminacijo citostatikov [29]. 2.4 Modeli in lastnosti tkiv Skupek po obliki in funkciji podobnih celic tvori tkivo. Tkivo po navadi modeliramo kot homogeno snov in računamo električno polje v odvisnosti od oblike in števila elektrod, parametrov električnih pulzov ter električnih lastnosti tkiva in sprememb njegove prevodnosti [30], [31]. Za vsak tip tkiva privzamemo s poskusi določeno kritično vrednost električnega polja, pri kateri pride do povečane prepustnosti membrane ali do celične smrti [32]. Z matematičnimi modeli lahko tudi napovemo verjetnost za ireverzibilno elektroporacijo tkiva [33] ali za termične poškodbe zaradi Joulovega segrevanja [34]. Transport snovi po tkivu lahko dobro opišemo s statističnimi modeli, ki ne vključujejo mehanizmov transporta [35], s kinetično shemo elektroporacije [17], [36], s farmakološkim modelom [37], z elektrodifuzijsko enačbo ali z modelom dvojne poroznosti [38]. Zanimiv organ za modeliranje je koža, saj ima izrazito slojevito strukturo. Pri elektroporaciji kože modeli opisujejo električno polje ali transport v koži kot organu iz posameznih homogenih plasti [39]. Električne lastnosti slojev pred elektroporacijo in po njej so večinoma približki, obenem so več slojem pripisane enake lastnosti [40]. Nekaj modelov vključuje tudi nastanek lokalnih transportnih območij [39], [41], a so omejeni le na procese v roženi plasti in ne zajemajo elektroporacije celic v spodnjih slojih kože. Transport molekul skozi roženo plast kože lahko dobro opišemo z Nernst- Planckovo enačbo [42]. MODELI ELEKTROPORACIJE NA VEČ RAVNEH 163 2.5 Modeli elektroporacije na več ravneh Modeli elektroporacije na več ravneh elektroporacijo opisujejo na različnih prostorskih ravneh, ki se med sabo razlikujejo v velikostnih razredih (od nanometrov do centimetrov). Nekaj modelov povezuje raven molekularne dinamike z ravnijo lipidnih dvoslojev. V [43], [44] so primerjali rezultate spremembe prevodnosti por, pridobljene s simulacijami molekularne dinamike in teoretičnimi modeli, ki sistem opisujejo na podlagi zveznih teorij. Ugotovili so, da je vrednost električne prevodnosti posamezne pore, izračunana z molekularno dinamiko ali zveznimi teorijami, primerljiva. Rezultati kvazistatične analize električnega polja so se dobro ujemali z rezultati molekularne dinamike [45]. Nekaj modelov povezuje raven lipidnih dvoslojev oz. celičnih membran z ravnijo posameznih celic ali tkiv. Model dvojne poroznosti, ki temelji na difuzijski enačbi, povezuje nastanek por s prepustnostjo celične membrane in omogoča modeliranje transporta med več razdelki, npr. celicami, zunajcelično tekočino in sosednjimi tkivi [38]. Transport ionov skozi celično membrano med pulzi lahko numerično ali z načelom ekvivalence izračunamo iz tokovno-napetostnih meritev prevodnosti celične suspenzije [46]. Več modelov, ki vključujejo tudi geometrijo posameznih celic, povezuje raven posameznih celic z ravnijo tkiva. V dveh dimenzijah lahko presek tkiva vzorčimo s kartezijskimi transportnimi mrežami in s Kirchoffovimi zakoni izračunamo tok, napetost ter električni naboj po celi mreži [47]. Podobno metodo ekvivalentnega vezja so uporabili v literaturi [48], kjer so najprej analizirali učinke elektroporacije na ravni celic, nato pa prek enakovrednih električnih lastnosti celic prešli na tkiva. V dveh dimenzijah odziv tkiva ponazorimo z modeliranjem celic z Voronojevim diagramom in izračunom vsiljene transmembranske napetosti v vsakem poligonu oz. celici [49]. Slabost zgornjih modelov je, da so v dveh dimenzijah, kjer je obnašanje celic drugačno kot v tridimenzionalnih tkivih. V tkivu so celice namreč gosto skupaj, povezane, pride do zastiranja električnega polja in posledično do nižje vsiljene transmembranske napetosti [50], [51], prisotna sta krvni obtok in imunski sistem. Povezavo med celicami in tkivom lahko ponazorimo s tridimenzionalnimi numeričnimi modeli mrež okroglih celic [52]. Simulacije so bile narejene za enako velike, popolnoma okrogle, pravilno razporejene in električno nepovezane celice, obenem pa je bil največji prostorninski delež celic omejen na nižje vrednosti kot v tkivih. Z numeričnim modeliranjem tridimenzionalnih okroglih različno velikih celic, naključno razporejenih po prostoru, lahko opišemo spremembo električne prevodnosti celične membrane in delež prepustnih celic [53]. S tridimenzionalnim modelom skupka posameznih celic različnih oblik so opisali tudi elektroporacijo lista špinače [54]. 2.5.1 Mehanistični model električnih lastnosti kože Elektroporacija vpliva na električno prevodnost celične membrane [55], sloja celic [56] in tkiv [57], kar lahko uporabimo za napoved odziva na zdravljenje z elektroporacijo. Na splošno se med pulzi prevodnost tkiv poveča, saj se poveča prevodnost celičnih membran. Po pulzih pa je sprememba prevodnosti posledica uhajanja ionov iz celic, osmotskega večanja celic, vaskularne okluzije, nastanka edema ter je lahko večja ali manjša kot pred elektroporacijo. Z metodo končnih elementov smo zgradili numeričen model električnih lastnosti kože med elektroporacijo [58]. Kot model kože pred elektroporacijo smo uporabili že obstoječi model [59], kjer so lastnosti posameznih slojev kože izračunane prek električnih in geometrijskih lastnosti posameznih celic. Električne lastnosti slojev z majhnim prostorninskim deležem celic smo izračunali s Hanai-Bruggemanovo formulo, ki spada med t. i. enačbe mešanja, lastnosti slojev s prostorninskim deležem nad 80 % pa numerično. Geometrija bioloških celic (na sliki 1) je bila opisana s t. i. superformulo [60], s katero lahko opišemo tako rekoč katero koli obliko v naravi. Celični membrani, znotraj- in zunajcelični tekočini ene biološke celice smo pripisali ustrezno električno prevodnost in dielektričnost in celico izpostavili sinusni napetosti različnih frekvenc v vseh treh koordinatnih oseh (x, y, z). Z upoštevanjem admitance smo nato izračunali frekvenčno odvisen kompleksen tenzor električnih lastnosti enotske celice (𝜀*̿). Posameznim plastem v homogenemu modelu kože smo pripisali izračunane električne lastnosti ene enotske celice in numerične izračune poenostavili na raven homogenih modelov tkiva, kjer so izračuni hitrejši in preprostejši. Slika 1: Geometrija posameznih gradnikov plasti kože v numeričnem modelu: a) keratinocita, b) korneocita in c) krogel lipidov v papilarnem dermisu, s katerimi smo izračunali ekvivalentne električne lastnosti rožene plasti, epidermisa in papilarnega dermisa. Prikazana je osmina enotske celice, saj so bili zaradi simetrije bioloških celic izračuni lahko narejeni na osmini celic. Povzeto po [58]. 164 DERMOL-ČERNE, MIKLAVČIČ Pri elektroporaciji kože pride do dveh pojavov – v vrhnji roženi plasti nastanejo lokalna transportna območja ('luknje' s premerom do več sto mikrometrov), na membranah celicah spodnjih plasti pa pore. Zaradi elektroporacije se spremeni električna prevodnost vseh plasti kože, kar lahko opazujemo s tokovno-napetostnimi meritvami. Pri elektroporaciji kože z dolgimi nizkonapetostnimi pulzi se spreminja velikost lokalnih transportnih območij, saj Joulovo segrevanje povzroči topljenje lipidov. Spremembo velikosti lokalnih transportnih območij med nizkonapetostnimi pulzi smo privzeli iz literature [61], kjer so širjenje por izračunali iz termičnega obnašanja lipidov. Obenem smo z asimptotsko enačbo por [62] izračunali gostoto por na celičnih membranah celic spodnjih plasti. Ugotovili smo, da lahko dobro opišemo elektroporacijo z dolgimi nizkonapetostnimi pulzi, če upoštevamo spremembe prevodnosti posameznih plasti kože. Modelirana in izmerjena [61] tok in napetost vidimo na sliki 2. Slika 2: Z modelom električnih lastnosti kože smo opisali tokovno-napetostne meritve pri elektroporaciji kože z dolgimi nizkonapetostnimi pulzi. Povzeto po [58]. Naš model je primer večnivojskega modela, ki je povezal procese, ki se med elektroporacijo dogajajo na ravni celic (nastanek por v celični membrani), plasti v koži (nastanek lokalnih transportnih območij v roženi plasti), s tkivi (plasti kože) in celo organom (koža). Zgradili smo torej ne le večnivojski model elektroporacije kože, temveč smo v model vključili mehanizme elektroporacije. Mogoči nadgradnji modela sta merjenje in določitev časovne odvisnosti števila lokalnih transportnih območij v koži ter njihove velikosti in električne prevodnosti, saj so vrednosti teh parametrov trenutno le ocenjene. Podoben model bi lahko zgradili še za druga tkiva, ki jih pogosto zdravimo z elektroporacijo, npr. jetra ali mišice. 2.5.2 Mehanistični model transporta kemoterapevtika v celice in po tkivih Transport zaradi elektroporacije prek celične membrane je posledica treh mehanizmov: difuzije [28], elektroforeze [63] in endocitoze [64], na ravni tkiva sta prisotna difuzija in konvekcijski transport po intersticijskem prostoru, k transportu pa prispeva še limfni sistem. Znotraj tumorjev je transport v primerjavi z drugimi tkivi dodatno otežen, saj imajo tumorji abnormalno ožilje, povišan intersticijski tlak, ki pripomore k izpiranju zdravil iz tumorjev, in okvarjen limfni sistem [65]. Pri zdravljenju tumorjev z elektrokemoterapijo je pomembno, da je na tumorju vzpostavljeno dovolj visoko električno polje [66], obenem pa mora v celice priti dovolj molekul kemoterapevtika, da zagotovimo celično smrt [67]. Pri načrtovanju posegov je torej poleg porazdelitve električnega polja smiselno modelirati tudi transport kemoterapevtika. Trenutno pri načrtovanju posegov in napovedovanju uspešnosti zdravljenja upoštevamo le izračun električnega polja, ne pa tudi transporta kemoterapevtika v tumorske celice, kar lahko pripelje do precenitve učinkovitosti zdravljenja. S ciljem, da bi upoštevali transport kemoterapevtika pri načrtovanju posegov elektrokemoterapije, smo zasnovali naslednji model. Zgradili smo numeričen model tumorja [68], kjer smo z modelom dvojne poroznosti [38] izračunali koeficient prepustnosti celične membrane v odvisnosti od parametrov električnega polja. V numeričnem modelu tumorja smo s koeficientom prepustnosti izračunali transport po tumorju pri elektrokemoterapiji ter rezultate modela primerjali z meritvami znotrajcelične mase kemoterapevtika cisplatina v podkožnih tumorjih na miših. Upoštevali smo tudi, da je v tkivu zaradi bližine celic, visokega volumskega deleža celic ter prisotnosti celičnega matriksa za transport na voljo manjša površina membrane. Ugotovili smo, da se rezultati modela dobro ujemajo z meritvami. Prostorska koncentracija kemoterapevtika v tumorju eno uro po dovedenih električnih pulzih je nehomogena (slika 3), kar lahko vpliva na učinkovitost zdravljenja, če je v določenem delu tumorja koncentracija prenizka. Naš model ponuja korak naprej pri modeliranju transporta po elektroporaciji tkiv, upoštevajoč transport na ravni ene celice. S tem modelom bi lahko zmanjšali število poskusov ter napovedali ali izboljšali učinkovitost zdravljenja pri elektrokemoterapiji. Z modeli transporta MODELI ELEKTROPORACIJE NA VEČ RAVNEH 165 kemoterapevtikov po tumorju bi lahko parametre zdravljenja optimizirali tako, da bi dosegli želeno znotrajcelično koncentracijo cisplatina oz. točno število molekul v posameznih celicah. Mogoči nadgradnji modela sta vključitev konvekcijskega transporta v tumorju in modeliranje začetne porazdelitve cisplatina po intratumorski injekciji, za izboljšanje natančnosti modela pa bi potrebovali še natančne meritve prostorske porazdelitve cisplatina v tumorjih pred elektroporacijo in po njej ter meritve hitrosti vezave cisplatina na druge netarčne molekule. Slika 3: Izračunana porazdelitev a) znotrajcelične in b) zunajcelične koncentracije cisplatina v tumorju v mol/m3. Koncentracija obeh je najvišja v sredini tumorja, saj je bil cisplatin doveden intratumorsko, nato pa postopoma upada do roba tumorja. Zaradi simetrije problema smo lahko modelirali le osmino tumorja. Povzeto po [68]. 3 SKLEP Modele elektroporacije uporabljamo za opis in preverjanje svojega znanja ter razumevanja pojava, zmanjševanje števila potrebnih poskusov, povečanje učinkovitosti terapij ter njihovo optimizacijo in načrtovanje. Ker modeli omogočajo strnjen opis elektroporacije, je smiselno dopolnjevati in nadgrajevati obstoječe ter razvijati nove. Osnova za dobre modele so dobre meritve, zato je v prihodnosti treba izboljšati obstoječe meritve, povečati njihovo število in načrtovati nove. Eden od problemov obstoječih modelov elektroporacije je namreč ravno pomanjkanje meritev. Nekateri obstoječi modeli so izjemno kompleksni, vrednosti njihovih parametrov so večinoma le ocenjene na velikostni razred. Z optimizacijo parametrov modelov lahko torej najdemo več lokalnih minimumov, ne pa nujno globalnega. ZAHVALA Raziskave je podprla Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije (ARRS) v okviru programov P2-0249 in IP-0510. Raziskave so bile izvedene v okviru Evropskega laboratorija za aplikacije pulznih električnih polj v biologiji in medicini (LEA EBAM). Avtorja se za pomoč in ideje pri nastanku opisanega dela zahvaljujeta dr. S. Huclovi, dr. L. Rems in dr. M. Reberšku.