1 UVOD
1.1 Elektroporacija
Že pred štiridesetimi leti so ugotovili, da dovolj močno
električno polje lahko povzroči strukturne spremembe v
celični membrani, s čimer se poveča prepustnost
membrane za ione in molekule [1,2]. Proces je bil
poimenovan elektroporacija, saj naj bi med električnim
pulzom v membrani nastale pore, ki omogočijo
prehajanje vodotopnih ionov in molekul. Včasih se
uporablja tudi izraz elektropermeabilizacija, ki poudarja
povečano prepustnost membrane. Na splošno je ključni
parameter za uspešno permeabilizacijo inducirana
transmembranska napetost [3,4], ki nastane ob
prisotnosti zunanjega električnega polja zaradi razlike v
električnih lastnostih membrane in zunanjega medija.
Po električnem pulzu se membrana popolnoma zaceli,
če le pulz ni preveč dolg ali previsok. Proces celjenja
traja nekaj minut, kar omogoča prehajanje molekul iz
zunanjosti v notranjost celice. Če jakost električnega
polja še povečamo oziroma uporabimo daljše ali več
pulzov, pride do irreverziblnih sprememb in celica
umre. Elektroporacijo uporabljajo v in vitro in in vivo
Prejet 29. november, 2013
Odobren 9. december, 2013
GENSKA ELEKTROTRANSFEKCIJA: VPLIVAJO ELEKTRIČNI PULZI TUDI NA CELICE, KI JIM NISO BILE NEPOSREDNO… 209
poskusih na živalih in v kliničnih študijah, kljub temu
pa molekularni mehanizmi še niso pojasneni [2,5].
1.2 Elektrogenska transfekcija
Prvi poskusi leta 1982 so pokazali, da lahko z visoko-
napetostnimi pulzi (elektroporacijo) dosežemo
transfekcijo celic – vnesemo gene, ki se nato tudi
izražajo [1]. Metoda temelji na uporabi plazmidne DNK
ter električnih pulzov, ki povečajo prepustnost celične
membrane za to makromolekulo. Danes je
elektrogenska transfekcija že uveljavljena metoda za
vnos genov in vitro, trenutno poteka vrsta raziskav na
živalskih modelih in vivo [2,5], v teku pa so tudi prvi
klinični preizkusi elektrogenske terapije (EGT).
Elektrogenska transfekcija je v primerjavi z virusno
transfekcijo varnejša metoda, saj ne uporablja virusnih
vektrojev ter tako ne pomeni povečanega tveganja za
stranske učinke, ki so se že pokazali pri nekaterih
kliničnih preizkusih virusne transfekcije [5].
Elektrogenska transfekcija je v primerjavi z drugimi
nevirusnimi metodami tudi nabolj vsestranska in
učinkovita metoda. Tako je na primer metoda »gene
gun« omejena in primerna samo za uporabo na
izpostavljenih tkivih, kationski liposomi oziroma
polimeri pa so lahko nestabilni, toksični oziroma lahko
povzročijo vnetja. Zadnje raziskave so pokazale, da je
elektrogenska terapija obetavna metoda za zdravljene
raka, za DNK vakcinacijo, za avtoimune in vnetne
bolezni in še za vrsto drugih bolezni in kroničnih
obolenj [5].
Za razlago mehanizma vnosa DNK z električnimi
pulzi so raziskovalci na tem področju predlagali več
mehanizmov. Prve hipoteze so predvidevale, da
električno polje ustvari pore v celični membrani, kar
omogoča difuzijo DNA prek membrane v celico,
podobno kot velja za vnos manjših molekul [1]. Ta
hipoteza temelji na dejstvu, da je tudi elektrogenska
transfekcija učinkovita samo nad neko pragovno
vrednostjo električnega polja, prav tako pa je
učinkovitost odvisna od parametrov električnih pulzov.
Vendar pa so nadaljnje raziskave pokazale, da je vnos
DNA z električnimi pulzi bolj zapleten proces, ki ga ne
moremo razložiti s preprosto difuzijo skozi pore, ki
nastanejo zaradi elektroporacije [6-14]. Parametri, ki v
nasprotju s klasično elektroporacijo zelo vplivajo na
učinkovitost genske elektrotransfekcije, so tudi
temperatura, osmolarnost medija in topologija molekule
DNA.
Definiramo lahko več korakov, ki so kritični za
uspešnost metode [7,8,11–14], med katere spadajo
vsiljena transmembranska napetost, ki povzroči
elektropermeabilizacijo celične membrane [15,16], stik
med permeabilizirano membrano in plazmidno DNK,
translokacija skozi membrano, ki ji sledi prehod po
citoplazmi do jedra, vstop v jedro in ekspresija
vnesenega gena. Ker so za uspešno ekspresijo
pomembni tudi biološki dejavniki, je pomembno, da
ohranimo dobro preživetje celic [6-14]. Poleg tega se je
treba zavedati, da na elektroporacijo vplivajo velikost,
oblika celic in orientacija celic [15–17] in da so celice v
tkivu različno velike in tudi različno orientirane glede
na smer  zunanjega električnega polja. Stopnja
elektroporacije pa vpliva na to, ali bodo celice
reverzibilno elektroporirane in bodo preživele ali bodo
električni pulzi povzročili tako velike poškodbe, da jih
celica ne bo sposobna popraviti in bodo celice odmrle
(ireverzibilna elektroporacija). Za gensko
elektrotransfekcijo je pomembno, da so celice
reverzibilno elektroporirane, kar pomeni, da se po
dovajanju električnih pulzov celična membrana zaceli in
celica vzpostavi homeostazo. Ker fiziološko stanje
celice po elektroporaciji določa uspešnost transfekcije,
je zelo pomembno razumeti, kako umirajoče celice
(zaradi ireverzibilne elektroporacije) vplivajo na
sosednje celice in na njihovo preživetje.  Ta vidik je še
posebno pomemben, kadar imamo za elektrotransfekcijo
na voljo majhno število težko dostopnih celic  in želimo
dobiti velik delež preživelih transficiranih celic.
V našem prispevku smo ovrednotili ta vidik
elektrogenske transfekcije tako, da smo ovrednotili
vpliv snovi (signalnih molekul), ki jo izločajo
elektroporirane celice, na sosednje netretirane celice.
Elektroporirane celice so bile izpostavljene pulzom, pri
katerih je bil delež celic ireverzibilno poškodovan.
Snovi teh celic so se izločile v elektroporacijski pufer.
Tem snovem so bile izpostavljene sodednje celice, ki so
rastle v isti gojitveni posodici pri poskusih na pritrjenih
celicah, ali pa smo pufer z izločenimi snovmi
elektroporiranih celic ostranili s centrifugiranjem in tako
ločili elektroporirane celice in supernatant (pufer, ki je
vseboval izločene snovi). Ta supernatant smo nato
dodali neelektroporiranim celicam in določili vpliv na
preživetje.
2 TEORETIČNO OZADJE
Pod vplivom zunanjega električnega polja se na celični
membrani ustvari potencialna razlika, ki je posledica
Maxwell-Wagnerjeve polarizacije. Z drugimi besedami,
pod vplivom električnega polja se notranjost celice
polarizira, kar povzroči napetost na membrani – vsiljeno
transmembransko napetost . Nad nekim kritičnim
poljem, ko se ustvari kritična transmembranska
napetost-c), se poveča prepustnost celične membrane
za molekule, ki sicer ne prehajajo čez membrano, to je t.
i. reverzibilna permeabilizacija. Nadaljnje povečanje
polja pa povzroči ireverzibilne sprememebe mebrane, ki
privedejo do celične smrti. Kot smo že omenili, je
površina celice, izpostavljena nadkritični napetosti,
pomemben parameter za uspešno elektro-
permeabilizacijo. Zato je pomembno poznavanje
porazdelitve vsiljene transmembranske napetsti na
celici.
Vsiljena transmembranska napetost je neenakomerna
po celici, največja na polih celice in najmanjša na
ekvatorju, odvisna pa je od lastnosti celice in gostote
210 PAVLIN, KUMER, KANDUŠER
celic [3,4]. Vsiljeno transmebransko napetost na okrogli
celici (slika 1) določa Schwanova enačba:
/
0
( ) cos 1 ,
t
g R E e

 

      (1)
kjer je  napetost, ki se ustvari na membrani. Časovna
konstanta  je:
,
2
2
m
e i
m
e i
R c
R
d

 

 



(2)
kjer je cm =m/d kapacitivnost membrane. Časovna
konstanta   predstavlja karakteristični čas polarizacije
membrane, ki je obratno sorazmeren s frekvenco, pri
kateri pride do betadisperzije. Za statični primer se ta
enačba poenostavi v:
0
( ) cos .g R E    (3)
Faktor g je odvisen od prevodnosti  membrane,
citoplazme in zunanjega medija [4]. Pri normalnih
fizioloških razmerah velja d << R in σm << σe, σi  [13],
tako da se zgornja enačba poenostavi v:
0
1.5 cos ,R E    (4)
v primeru, ko imamo nizko prevoden medij ali
povečano prevodnost membrane, pa moramo uporabiti
natančno enačbo. Faktor 1.5 lahko preprosto izpeljemo
tako, da izračunamo polarizacijo neprevodne krogle v
prevodnem zunanjem mediju.
Pri elektroporaciji se zaradi strukturnih sprememb v
membrani poveča prevodnost membrane. Posledica
povečane prevodnosti je tako imenovano sesedanje
vsiljene transmembranske napetosti, saj zaradi
neenakomerne prevodnosti po površini membrane
Schwanova enačba ne velja več.
Transmembranski potencial na celici, ki je
permeabilizirana, lahko izračunamo po analitični ali
numerični poti [4]. Rešujemo Laplace-ovo enačbo v
sferičnih koordinatah, ki mora veljati v celici in zunaj
nje:
( , , ) ( , , ) 0 .
i e
r r          (5)
Na membrani velja robni pogoj o ohranitvi toka:
( ) ( ) ,
i e
j R j R  (6)
iz česar sledi:
  ,i ei e e i r R
r R r R
G
r r
 
   

 
 
  
 
   
   
   
(7)
kjer je G prevodnost membrane. Uvedimo še
brezdimenzijske količine:
0 0
, , ' / ,
/ , ( ) / ( ) .
i e
i e
i e i
r r R
RE RE
g R G
 
     
    
 
(8)
Funkcija g() opisuje prevodnost membrane, ki je
odvisna od stopnje permeabilizacije in kota :
 
 
' 1
' 1
/ '
( ) .
r
i
e i r
r
g 


 

 
(9)
Rešitvi Laplaceove enačbe zunaj celice in v njej lahko
formalno zapišemo z razvojem po multipolih:
 
n
0
1
' P (cos )
,
n
n
i
n
rc
c
n


    (10)
n
12 1
1 '
P (cos )1
' P (cos ) .
2 ' ( 1)( )
n
e n
n r
c
r
r n

 



   

 
  
 (11)
Enačbe lahko rešimo analitično (dipolni približek) ali
numerično [4].
Slika 1: Model permeabilizirane celice, temno osenčeno
območje označuje neprevodno membrano, svetleje osenčeni
pas pa permeabilizirani del.
Iz Schwanove enačbe lahko tudi izračunamo delež
permeabilizirane površine membrane Sc, kjer
transmembranska napetost presega kritično vrednost
( > c). Najprej definirajmo kritični c kjer velja
 = c, iz česar sledi:
0
1.5 cos .
c c
R E    (12)
Kritično polje Ec definirajmo kot polje, kjer je c = 0,
torej velja: Ec= Uc /1.5R.  Iz zgornjih enačb tako lahko
izračunamo permebiliziran delež površine Sc :
0
(1 / ),
c c
S S E E   (13)
ki je odvisen od zunajega električnega polja, S0 pa je
celotna površina celične membrane.
Iz tega je razvidno, da zunanje električno polje
ključno določa delež permeabilizirane površine – to je
površine, čez katero poteka transport ionov,  molekul pa
tudi plazmidne DNK, kar je ključno za uspešno
elektrotransfekcijo [13]. Seveda pa sam vnos molekul in
inov določa še vrsta drugih parametrov, od fizikalnih
(velikost molekul, drugi parametri pulzov, temperatura)
do bioloških (celična linija, fiziološko stanje celice,
itd.).
GENSKA ELEKTROTRANSFEKCIJA: VPLIVAJO ELEKTRIČNI PULZI TUDI NA CELICE, KI JIM NISO BILE NEPOSREDNO… 211
3 MATERIALI IN METODE
3. 1. Celične kulture
Za poskuse smo uporabili celično linijo CHO (ovarijske
celice kitajskega hrčka; Evropska zbirka celičnih kultur,
Velika Britanija) in in jo gojili v F-12HAM z dodanimi
10 % seruma telečjega zarodka in 0,15 mg/ml L-
glutamina (Sigma-Aldrich Co, USA).
Za elektroporacijo smo uporabili 10 mM izosmolarni
fosfatni pufer (Na2HPO4)/NaH2PO4 z dodanim
magnezijevim kloridom (MgCl2) in saharozo.
3.2 Genska elektrotransfekcija
3.2.1  Pritrjene celice
Celice v eksponencialni fazi rasti smo nasadili v
mikrotiterske plošče s 24 razdelki v koncentraciji 5 ×
10
4
celic na razdelek. Celice smo gojili 24 ur v
inkubatorju. Pred poskusom smo odstranili gojišče in
dodali 150 µl fosfatnega pufra s plazmidom pEGFP-N1
v koncentraciji 10 µg/ml (Clonotech, ZDA), ki nosi
zapis za protein GFP (Green Flourescent Protein). Dve
do tri minute pozneje smo vzorec izpostavili električnim
pulzom. Za elektroporacijo smo uporabili Cliniporator
(IGEA s.r.l., Carpi, Modena, Italija). Vsak razdelek v
mikrotiterski plošči smo izpostavili štirim električnim
pulzom dolžine 200 µs, s ponavljalno frekvenco 1 Hz (4
× 200 µs) in določeno amplitudo električnega polja.
Dovedene amplitude električnega polja so bile: 0.3, 0.4,
0.6, 0.8, 1.0, 1.2 in 1.4 kV/cm. Razdalja med
elektrodama je bila 4 mm. Kontrolne celice niso bile
izpostavljene električnim pulzom. V vsak razdelek smo
nato dodali 1 ml gojišča in celice dali za 24 ur v
inkubator na 37 °C.
Slika 2: Pritrjene celice CHO pod invertnim fluorescentnim
mikroskopom: a) celice v negativni kontroli (E = 0 kV/cm)
pod faznim kontrastom, b) pripadajoča fluorescenca; c) celice,
izpostavljene električnemu polju (E = 1.4 kV/cm) in d),
pripadajoča fluorescenca, kjer celice izražajo protein GFP
Po štiriindvajsetih urah smo določili delež uspešno
transficiranih celic na mikroskopskih slikah pri 20-
kratni povečavi objektiva z invertnim fluorescentnim
mikroskopom (Axiovert 200, Zeiss, Nemčija). Zajeli
smo vsaj sedem parov slik celic med elektrodama
(MetaMorph imaging system, Visitron, ZR Germany).
Vsak par je vseboval eno sliko faznega kontrasta (vse
celice pri izbranem parametru) in eno sliko fluorescence
(samo celice, ki so bile uspešno transficirane in izražajo
GFP). Uspešnost transfekcije smo določili kot količnik
celic, ki izražajo GFP in vseh celic v izbranem polju.
Vsi poskusi so bili ponovljeni vsaj štirikrat v različnih
dneh.
3.2.2 Celice v suspenziji
Gensko elektrotransfekcijo pri celicah v suspenziji smo
določili na celicah CHO, ki so bile v eksponencialni fazi
rasti. Celice smo tripsinizirali z 0.25-odstotno raztopino
tripsin/EDTA (Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Deisenhofen, Nemčija), nato pa smo jih pet minut
centrifugirali pri 1000 obratih/minuto in 4 °C.
Supernatant smo odstranili, pelet, v katerem so se
nahajale celice, pa smo resuspendirali v
elektroporacijskem pufru v koncentraciji 2.5 × 10
6
celic/ml.
Za dovajanje električnih pulzov smo uporabili kivete
z vgrajenimi 4 mm elektrodami (Eppendorf, Hamburg,
Nemčija). V vsako kiveto smo dali 200 µl vzorca. Nato
smo dodali plazmid (pEGFP-N1) v koncentraciji 40
µg/ml. Po 2–3 minutni inkubaciji smo jih izpostavili
vlaku pluzov 4 × 200 µs z različnimi vrednostmi
električnega polja: E = 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4 in 1.6
kV/cm in ponavljalno frekvenco 1 Hz. Celice v
negativni kontroli niso bile izpostavljene električnim
pulzom.
Po elektroporaciji smo celice inkubirali pet min pri
37 °C, nato smo dodali gojišče in jih gojili še nadaljnjih
štiriindvajset ur. Celice smo tripsinizirali, jih
centrifugirali in suspenzijo v koncentraciji 1 x 10
6
celic/ml analizirali s pretočnim citomentrom (Coulter
EPICS Altra flow cytometer, Beckman Coulter
Electronics). Delež transficiranih celic, ki so izražale
GFP, smo določili pri 509 nm in za vsak parameter
ovrednotili 10.000 dogodkov.
Vse poskuse smo ponovili vsaj trikrat v različnih dneh.
3.3 Vpliv električnih pulzov na preživetje
elektroporiranih celic in celic, ki niso bile
izpostavljene električnim pulzom
3.3.1 Pritrjene celice
Poskus smo izvedli podobno kot gensko
elektrotransfekcijo pritrjenih celic, vendar celicam
nismo dodali plazmidne DNK. Uporabili smo vlak
pulzov  4 × 200 µs z različnimi vrednostmi električnega
polja: E = 0.3 kV/cm (U = 80 V), E = 0.6 kV/cm (U =
212 PAVLIN, KUMER, KANDUŠER
120 V),  E = 1.0 kV/cm (U = 200 V), E = 1.4 kV/cm
(U = 280 V) in elektrode v razdalji 2mm.
Preživetje celic smo določili štiriindvajset ur po poraciji
na slikah faznega kontrasta. Zajeli smo vsaj pet slik
celic med elektrodama (elektroporirane celice EP-
celice) in vsaj pet slik celic zunaj elektrod (sosednje
celice) za vsak parameter. Preživetje smo izračunali kot
razmerje števila vseh celic v negativni kontroli in števila
vseh preštetih celic pri določenem parametru.
Predpostavili smo, da so celice v kontroli stoodstotno
viabilne.
Vsi rezultati so predstavljeni s srednjimi vrednostmi
in standardnimi deviacijami.
3.3.2 Celice v suspenziji
Celice smo tripsinizirali, centrifugirali in pelet
resuspendirali v elektroporacijskem pufru tako, da smo
dobili koncentracijo  2.5 × 10
6
celic/ml.
Za dovajanje električnih pulzov smo uporabili kivete
z vgrajenimi 4 mm elektrodami (Eppendorf, Hamburg,
Nemčija).
V vsako kiveto smo dali 150 µl vzorca. Celice smo
izpostavili vlaku pulzov  4 × 200 µs z različnimi
vrednostmi električnega polja: E = 1.4 kV/cm (U = 280
V) in E = 2 kV/cm (U = 400 V). Celice v negativni
kontroli niso izpostavljene električnimim pulzom.
Elektroporirane celice (EP celice) smo po
elektroporaciji ponovno centrifugirali in  resuspendirali
v elektroporacijskem pufru, medtem ko smo supernatant
dodali celicam, ki niso bile izpostavljene električnim
pulzom (supernatant).
Vzorce vseh celic smo odpipetirali v mikrotitrske
plošče s 96 razdelki ter jih inkubirali na 37 °C za pet
minut in jim nato dodali gojišče. Preživetje smo določili
s testom MTS po navodilih izdelovalca 24 in 48 ur po
elektroporaciji. Preživetje celic smo določili kot
razmerje med izmerjenimi vrednostmi v vzorcih in
vrednostm,i izmerjenimi v negativni kontroli. Naredili
smo tri neodvisne poskuse za vsak parameter in
rezultate predstavili kot srednjo vrednost ± standardna
napaka.
4 REZULTATI IN RAZPRAVA
V že objavljenih delih [11–16] smo analizirali vpliv
jakosti električnega polja na elektrogensko transfekcijo
CHO celice (pritrjenih in v suspenziji), prikazano na
sliki 3.
A)
0 0.5 1 1.5
0
20
40
60
80
100
E[kV/cm]
%
T
ra
n
s
fe
k
c
ije
%izražanja GFP - pritrjene celice
B)
0 0.5 1 1.5
0
20
40
60
80
100
E[kV/cm]
%
T
ra
n
s
fe
k
c
ije
%izražanja GFP - celice v suspenziji
Slika 3: Delež elektrotransfekciranih CHO-celic v odvisnosti
od jakosti električnega polja E = U/d A) pritrjenih celic  in B)
celic v suspenziji. Celice so bile izpostavljene vlaku 4 pulzov
4 × 200 µs, 1 Hz ponavljalne frekvence.
Objavljene rezultate smo nadgradili z novimi poskusi, s
katerimi smo ovrednotili vpliv električnih pulzov na
celice, ki jim niso bile neposredno izpostavljene.
Primerjali smo pritrjene celice in celice v suspenziji in
določili delež preživelih celic (slika 4). Z naraščajočo
električno poljsko jakostjo preživetje upada. Zanimalo
nas je tudi, ali take celice proizvajajo kakšne signalne
molekule, ki vplivajo na preživetje sosednjih celic. Pri
poskusih na pritrjenih celicah smo določili preživetje
celic, ki so se nahajale zunaj območja električnih pulzov
(celice v okolici).
Pri celičnih suspenzijah pa smo ugotavljali vpliv
supernatanta elektroporiranih celic na preživetje ne-
elektroporiranih celic.
GENSKA ELEKTROTRANSFEKCIJA: VPLIVAJO ELEKTRIČNI PULZI TUDI NA CELICE, KI JIM NISO BILE NEPOSREDNO… 213
A)
B)
Slika 4: Vpliv amplitude električnih pulzov na preživetje
pritrjenih CHO-celic: A) Celice smo izpostavili vlaku štirih
električnih pulzov 4×2 00 µs, 1 Hz ponavljalne frekvence,
amplituda pulzov je bila 300V/cm, 600V/cm, 1 kV/cm in 1.4
kV/cm – EP celice, B) pritrjene celice, ki niso bile
izpostavljene električnim pulzom (celice v okolici) v istem
razdelku mikrotiterske plošče kot elektroporirane celice –
celice v okolici. Rezultati so predstavljeni kot srednja vrednost
treh neodvisnih poskusov  ± standardna napaka.
Na sliki 4 A je prikazano zmanjšanje deleža živih celic
v odvisnosti od jakosti električnega polja za pritrjene
celice, izpostavljene električnim pulzom. Kot smo
pričakovali in v skladu z našimi že objavljenimi
rezultati [11–13], preživetje celic vpada z naraščajočo
amplitudo električnih pulzov.
Da bi ugotovili, kako vpliva fiziološko stanje
elektroporiranih umirajočih celic na sosednje celice,
smo določili tudi njihovo preživetje glede na kontrolo
(slika 4B). Te celice so rastle v neposredni bližini
elektroporiranih celic. Iz grafa je razvidno, da
elektroporacija celic ne vpliva na preživetje sosednjih
celic. Viabilnost teh celic je 100-odstotna in vsa
odstopanja lahko pripišemo napaki poskusov. Pri
napetostih 300, 600 V/cm in 1 kV/cm opazimo tendenco
boljšega preživetja v primerjavi s celicami negativne
kontrole. Pri teh poskusih smo preživetje celic določili
24 ur po izpostavitvi električnim pulzom, ko razlike še
niso bile tako očitne. Pri deležu preživetja pritrjenih
celic (slika 4) je opaziti visoko variabilnost (visoke
vrednosti standardne napake), kar lahko pripišemo
razlikam v obliki celic, velikosti in orientaciji glede na
smer električnega polja. Vsi našteti dejavniki
pripomorejo k nehomogeni elektroporaciji in posledično
k razlikam v deležu preživelih celic po elektroporaciji.
Preživetje celic v okolici je ostalo višje od 90 % tudi, ko
so bile elektroporirane celice izpostavljene vlaku pulzov
z amplitudo 1.4 kV/cm.
Da bi dobili jasnejšo sliko o vplivu elektroporiranih
celic na neelektroporirane celice, smo naredili dodatne
poskuse, pri katerih  smo uporabili celice v suspenziji.
Te celice so okrogle in imajo manjši razpon velikosti
kot pritrjene celice zato na ta način lahko izločimo vpliv
velikosti in oblike celic na elektroporacijo in
zmanjšamo variabilnost eksperimentalnih rezultatov.
Delež preživelih celic smo določali  24 in  48 ur po
elektroporaciji.
A)
B)
Slika 5: Celice v suspenziji, ki smo jih izpostavili 4×200 µs
pulzom 1 Hz in A) amplitude 1.4 kV/cm in amplitude 2.0
kV/cm. Delež preživelih celic smo določili 24  in 48 ur po
tretmaju. EP-celice so bile neposredno izpostavljene
električnim pulzom, celice z oznako supernatant pa so bile
izpostavljene supernatantu elektroporiranih celic. Rezultati so
predstavljeni kot srednja vrednost treh neodvisnih poskusov ±
standardna napaka.
214 PAVLIN, KUMER, KANDUŠER
Na sliki 5A so predstavljeni rezultati deleža preživelih
celic, ki smo jih izpostavili vlaku štirih električnih
pulzov z amplitiudo 1.4 kV/cm (EP celice),  in celic, ki
smo jih izpostavili supernatantu elektroporiranih celic
(supernatant).  Prva dva stolpca rezultatov prikazujeta
delež preživelih celic 24 ur po elektroporaciji, medtem
ko druga dva stolpca predstavljata preživetje celic 48 ur
po tretmaju. Po 24 urah opazimo vpad deleža preživelih
elektroporiranih celic, preživetje celic, ki so bile
izpostavljene samo supernatantu, pa ostaja na ravni
kontrolnih netretiranih celic. Isti vzorec po 48 urah kaže
podoben delež živih celic kot en dan prej za
elektroporirane celice. Delež preživelih celic, ki so bile
tretirane s supernatantom poriranih celic, pa je povečan
na 140 % kontrole in ta razlika je višja od variacij zaradi
eksperimentalne napake poskusov.
Na sliki 5B vidimo delež preživelih celic pri
električnih pulzih napetosti 2 kV/cm. Tudi pri tej
napetosti opazimo podoben odziv. Celice, ki niso bile
neposredno izpostavljene električnim pulzom, rastejo
bolje kot celice v kontroli in razlika je največja 48 ur po
elektroporaciji.
Naše rezultate bi lahko pojasnili s predpostavko, da
elektroporirane celice v elektroporacijski pufer izločajo
snov, ki stimulira rast sosednjih celic. Ker je ta snov
prisotna v supernatantu, povzroči povečanje števila
celic, ki so bile tretirane s supernatantom. Iz do zdaj
objavljene literature ni razvidno, katera snov (signalna
molekula) bi to bila. Objavljene so bile študije, ki
opozarjajo, da pri elektroporaciji nastajajo prosti
kisikovi radikali ROS (reactive oxigene species) [18].
Zanimivo je tudi, da imajo molekule ROS dvojni učinek
na biološke procese v celici; učinkujejo tako zavirajoče
kot tudi stimulativno. Za gensko elektrotransfekcijo je
dobro preživetje celic zelo pomembno, še zlasti za vse
aplikacije, kjer imamo na voljo majhno število celic,
namenjenih elektrotransfekciji [13, 17].  Naši rezultati
pripomorejo k razumevanju odziva celic na izpostavitev
stresnim pogojem, ki jih pomenijo električni pulzi
amplitude 1–2 kV/cm. Razumevanje odziva celic je
pomemben korak, ki pripomore k prepoznavanju
različnih dejavnikov, vključenih v kompleksni proces
genske elektrotransfekcije. V pričujoči študiji smo
predstavili preliminarne rezultate, potrebne pa bodo
nadaljnje raziskave, ki bodo potrdile ali ovrgle naše
rezultate.  Širše pa so ti rezultati zanimivi za vse
aplikacije elektroporacije, od genske elektrotransfekcije
do elektrokemoterapije [19].
5 SKLEPI
Naši rezultati kažejo, da preživetje CHO-celic, ki so bile
izpostavljene električnim pulzom amplitude 1 kV/cm ali
več, z amplitudo električnega pulza pada. Če
primerjamo pritrjene celice in celice v suspenziji,
opazimo razliko v variabilnost rezultatov. Ta razlika je
posledica različnih velikosti in orientacij celic v
električnem polju, kar povzroči razlike v vsiljeni
transmembranski napetosti in posledično razlike v
elektroporaciji celične membrane [15, 16]. Rezultati
preživetja celic, ki niso bile neposredno izpostavljene
električnim pulzom, temveč samo poracijskemu pufru
elektroporiranih celic, kažejo boljše preživetje kot
kontrolne celice. Mogoče je, da elektroporirane celice v
pufer izločajo snov, ki vpliva na preživetje
neelektroporiranih celic. Rezultati so zanimivi, potrebne
pa bodo nadaljnje raziskave.